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小千100新蟲 (小有名氣)
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同源重組多片段連接做不出來，我想重新做但又不知道是哪里操作的問題，怎么改進? 已有3人參與
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使用的是諾維贊多片段連接試劑盒，引物用公司的在線軟件設計的。載體8000多bp，三個片段分別1019，381，250多。 1.載體用takara快切酶雙酶切30min，切膠回收，目的片段分別以之前的2個T載體擴增，一個質粒擴增，切膠回收。 2.分別稀釋跑膠估算載體、三個片段濃度，按片段長度計算大致每個片段需要多少ng，加入多少μl 3.按說明書分別加入4μl載體，三個片段2μl，1μl，1μl，酶和buffer分別2μl，4μl，總體積20μl。37度反應30min。 4.10μl重組產物轉化100μl大腸桿菌感受態(tài)，過夜培養(yǎng)挑單菌落（比較少） 5.挑了9個單菌落搖菌提了質粒，雙酶切都沒有切出片段。 6.同時我做了兩個陰性對照1和2，都長了很多單菌落。1是只加了載體4μl，加水至20μl.2是只加了三個片段，加水至20μl. @wizardfan @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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2樓2019-07-24 10:02:34
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3樓2019-07-24 12:13:01
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4樓2019-07-27 18:40:00
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小千100(淵博震天代發(fā)): 金幣+20, 鼓勵積極回帖 2019-08-11 15:21:03
小千100(淵博震天代發(fā)): 金幣+20, 鼓勵積極回帖 2019-08-11 15:21:03
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你是要做原核菌的同源重組嗎？我這兩天也剛查這方面的資料，簡單說一下我的見解，僅供交流。 三片段各自擴增好后，先進行連接，然后再把融合好的打靶片段通過TA克隆鏈接到載體上，轉入目的菌后進行篩選就可以。 大體流程是這樣，說著不難，但確實是做的過程中會有很多問題。 你上面提到的疑惑，多片段和載體共同連接轉化后，沒什么單菌落，那可能是連接效率不太好。 另外，你挑了單克隆搖菌提質粒，再雙酶切，是什么目的呢？連上了為什么又要切開？ 最后，你所謂的陰性對照1只加了載體，你指的是線性化的載體嗎？那不應該會長菌啊。如果是空載，是會有正常菌落的。 陰性對照2是加入了三個基因片段，理論上也不會長菌啊，為什么你的也有呢？ |
5樓2019-08-06 15:42:27
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謝謝你的解答。后面我咨詢了技術，說可能是原本我的載體就沒有切開，陰性對照加入片段長菌的可能是其中一個片段擴增用的模板殘留，這個模板質粒含有同樣的抗性，其實我也不清楚，后面我重新酶切了載體，重新操作了一遍，連接成功了，也是神奇  發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2019-08-06 19:04:15
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嗯嗯，也有同學推薦我那么做，后面我重新這樣操作連接成功了。陰性對照1是只加了線性化載體，長單菌落可能是我沒有切開；陰性對照2只加片段長菌可能是我其中一個片段用的擴增模板殘留了，那個質粒模板具有相同抗性。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2019-08-06 19:09:57
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是的，我覺得有時候碰運氣，后面我重復了就連成了，具體哪里問題我也不清楚。還有一個問題就是我其中一個酶切位點上下游GC含量偏低，沒達到說明書中的40%-60%之間。這個應該也是一個因素影響連接效率，總之嚴格按說明書的來應該不會錯的。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2019-08-06 19:14:38
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9樓2019-08-06 20:01:12
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