 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 10 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 8971 | 回復(fù): 9 | ||
小千100新蟲 (小有名氣)
|
[求助]
同源重組多片段連接做不出來，我想重新做但又不知道是哪里操作的問題，怎么改進(jìn)? 已有3人參與
|
|
使用的是諾維贊多片段連接試劑盒，引物用公司的在線軟件設(shè)計的。載體8000多bp，三個片段分別1019，381，250多。 1.載體用takara快切酶雙酶切30min，切膠回收，目的片段分別以之前的2個T載體擴(kuò)增，一個質(zhì)粒擴(kuò)增，切膠回收。 2.分別稀釋跑膠估算載體、三個片段濃度，按片段長度計算大致每個片段需要多少ng，加入多少μl 3.按說明書分別加入4μl載體，三個片段2μl，1μl，1μl，酶和buffer分別2μl，4μl，總體積20μl。37度反應(yīng)30min。 4.10μl重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μl大腸桿菌感受態(tài)，過夜培養(yǎng)挑單菌落（比較少） 5.挑了9個單菌落搖菌提了質(zhì)粒，雙酶切都沒有切出片段。 6.同時我做了兩個陰性對照1和2，都長了很多單菌落。1是只加了載體4μl，加水至20μl.2是只加了三個片段，加水至20μl. @wizardfan @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
推薦一些20種氨基酸檢測的實(shí)際應(yīng)用案例
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有249人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
小千100
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 86.4
- 帖子: 180
- 在線: 99.8小時
- 蟲號: 4262155
- 注冊: 2015-12-02
- 性別: MM
- 專業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
2樓2019-07-24 10:02:34
xinxiyuzhou
至尊木蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 78 (初中生)
- 金幣: 13452.5
- 散金: 55
- 紅花: 19
- 帖子: 2045
- 在線: 425小時
- 蟲號: 1304974
- 注冊: 2011-05-24
- 性別: GG
- 專業(yè): 神經(jīng)生物學(xué)
3樓2019-07-24 12:13:01
匿名
用戶注銷 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 128 (高中生)
- 金幣: 4550.4
- 散金: 50
- 紅花: 22
- 帖子: 934
- 在線: 645.1小時
- 蟲號: 0
- 注冊: 2011-10-17
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物遺傳學(xué)
4樓2019-07-27 18:40:00
prthefu
木蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 20 (小學(xué)生)
- 金幣: 2573.9
- 散金: 81
- 紅花: 14
- 沙發(fā): 1
- 帖子: 1551
- 在線: 187小時
- 蟲號: 3083070
- 注冊: 2014-03-24
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物海洋學(xué)與海洋生物資源
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小千100(淵博震天代發(fā)): 金幣+20, 鼓勵積極回帖 2019-08-11 15:21:03
小千100(淵博震天代發(fā)): 金幣+20, 鼓勵積極回帖 2019-08-11 15:21:03
|
你是要做原核菌的同源重組嗎？我這兩天也剛查這方面的資料，簡單說一下我的見解，僅供交流。 三片段各自擴(kuò)增好后，先進(jìn)行連接，然后再把融合好的打靶片段通過TA克隆鏈接到載體上，轉(zhuǎn)入目的菌后進(jìn)行篩選就可以。 大體流程是這樣，說著不難，但確實(shí)是做的過程中會有很多問題。 你上面提到的疑惑，多片段和載體共同連接轉(zhuǎn)化后，沒什么單菌落，那可能是連接效率不太好。 另外，你挑了單克隆搖菌提質(zhì)粒，再雙酶切，是什么目的呢？連上了為什么又要切開？ 最后，你所謂的陰性對照1只加了載體，你指的是線性化的載體嗎？那不應(yīng)該會長菌啊。如果是空載，是會有正常菌落的。 陰性對照2是加入了三個基因片段，理論上也不會長菌啊，為什么你的也有呢？ |
5樓2019-08-06 15:42:27
小千100
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 86.4
- 帖子: 180
- 在線: 99.8小時
- 蟲號: 4262155
- 注冊: 2015-12-02
- 性別: MM
- 專業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
|
謝謝你的解答。后面我咨詢了技術(shù)，說可能是原本我的載體就沒有切開，陰性對照加入片段長菌的可能是其中一個片段擴(kuò)增用的模板殘留，這個模板質(zhì)粒含有同樣的抗性，其實(shí)我也不清楚，后面我重新酶切了載體，重新操作了一遍，連接成功了，也是神奇  發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2019-08-06 19:04:15
小千100
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 86.4
- 帖子: 180
- 在線: 99.8小時
- 蟲號: 4262155
- 注冊: 2015-12-02
- 性別: MM
- 專業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
|
嗯嗯，也有同學(xué)推薦我那么做，后面我重新這樣操作連接成功了。陰性對照1是只加了線性化載體，長單菌落可能是我沒有切開；陰性對照2只加片段長菌可能是我其中一個片段用的擴(kuò)增模板殘留了，那個質(zhì)粒模板具有相同抗性。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2019-08-06 19:09:57
小千100
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 86.4
- 帖子: 180
- 在線: 99.8小時
- 蟲號: 4262155
- 注冊: 2015-12-02
- 性別: MM
- 專業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
|
是的，我覺得有時候碰運(yùn)氣，后面我重復(fù)了就連成了，具體哪里問題我也不清楚。還有一個問題就是我其中一個酶切位點(diǎn)上下游GC含量偏低，沒達(dá)到說明書中的40%-60%之間。這個應(yīng)該也是一個因素影響連接效率，總之嚴(yán)格按說明書的來應(yīng)該不會錯的。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2019-08-06 19:14:38
匿名
用戶注銷 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 128 (高中生)
- 金幣: 4550.4
- 散金: 50
- 紅花: 22
- 帖子: 934
- 在線: 645.1小時
- 蟲號: 0
- 注冊: 2011-10-17
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物遺傳學(xué)
9樓2019-08-06 20:01:12
科研happy
新蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1801.9
- 散金: 1500
- 帖子: 1361
- 在線: 76.8小時
- 蟲號: 9708825
- 注冊: 2018-08-01
- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
您好，我也用的諾唯贊的酶，同時試了單片段連接和多片段連接，不管我換哪個感受態(tài)細(xì)胞，不管我加多少，都不長菌 ，求大神指教發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
10樓2019-08-10 10:26:59
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 小千100 的主題更新
| 10 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 312求調(diào)劑 +3 | 醋精華了一下發(fā)?/a> 2026-03-03 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 求調(diào)劑院校 +6 | 云朵452 2026-03-02 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 0854總分272 +5 | 打小就是老實(shí)人 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑一志愿中海洋 +3 | lour. 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 298 調(diào)劑 +3 | 小西笑嘻嘻 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 江蘇省農(nóng)科院招調(diào)劑1名 +5 | Qwertyuop 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[碩博家園] 2025屆雙非化工碩士畢業(yè)，申博 +4 | 更多的是 2026-02-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)085600 319分 材料與化工 金屬方向 求調(diào)劑 +4 | 青科11 2026-03-02 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +4 | Guo_yuxuan 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)碩318求調(diào)劑 +11 | February_Feb 2026-03-01 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 化工335求調(diào)劑 +5 | 摸摸貓貓頭 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 【2026 碩士調(diào)劑】課題組 招收調(diào)劑生 +3 | 考研版棒棒 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085600材料工程一志愿中科大總分312求調(diào)劑 +9 | 吃宵夜1 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考博] 26超級電容器申博 +3 | dhdjdjend 2026-02-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0856化工專碩求調(diào)劑 +15 | 董boxing 2026-03-01 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 265分求調(diào)劑不調(diào)專業(yè)和學(xué)校有行學(xué)上就 +6 | 禮堂丁真258 2026-02-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 哈工大計算機(jī)劉劼團(tuán)隊(duì)招生 +4 | hit_aiot 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 熬夜的貓頭鷹 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[基金申請]
 本子寫完了，給DS兄弟看了，得了92分
+3
|
Doma 2026-03-01 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑 +3 | 簡木ChuFront 2026-02-28 | 3/150 |
|