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小千100新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
同源重組多片段連接做不出來(lái)，我想重新做但又不知道是哪里操作的問(wèn)題，怎么改進(jìn)? 已有3人參與
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使用的是諾維贊多片段連接試劑盒，引物用公司的在線軟件設(shè)計(jì)的。載體8000多bp，三個(gè)片段分別1019，381，250多。 1.載體用takara快切酶雙酶切30min，切膠回收，目的片段分別以之前的2個(gè)T載體擴(kuò)增，一個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)增，切膠回收。 2.分別稀釋跑膠估算載體、三個(gè)片段濃度，按片段長(zhǎng)度計(jì)算大致每個(gè)片段需要多少ng，加入多少μl 3.按說(shuō)明書(shū)分別加入4μl載體，三個(gè)片段2μl，1μl，1μl，酶和buffer分別2μl，4μl，總體積20μl。37度反應(yīng)30min。 4.10μl重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μl大腸桿菌感受態(tài)，過(guò)夜培養(yǎng)挑單菌落（比較少） 5.挑了9個(gè)單菌落搖菌提了質(zhì)粒，雙酶切都沒(méi)有切出片段。 6.同時(shí)我做了兩個(gè)陰性對(duì)照1和2，都長(zhǎng)了很多單菌落。1是只加了載體4μl，加水至20μl.2是只加了三個(gè)片段，加水至20μl. @wizardfan @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
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4樓2019-07-27 18:40:00
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2樓2019-07-24 10:02:34
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| 有一個(gè)問(wèn)題呀，你的陰性對(duì)照不加片段或者載體應(yīng)該不會(huì)形成環(huán)狀質(zhì)粒，怎么會(huì)長(zhǎng)出菌落呢？另外，你可以試一下將三個(gè)片段通過(guò)PCR連接起來(lái)再克隆到載體上。諾唯贊來(lái)我們這推銷(xiāo)過(guò)這個(gè)試劑盒，我覺(jué)得沒(méi)有什么優(yōu)勢(shì)，即使你現(xiàn)在克隆上了，還是要切下來(lái)，再進(jìn)行后續(xù)的酶切連接，并沒(méi)有省事。個(gè)人建議。 |
3樓2019-07-24 12:13:01
prthefu
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小千100(淵博震天代發(fā)): 金幣+20, 鼓勵(lì)積極回帖 2019-08-11 15:21:03
小千100(淵博震天代發(fā)): 金幣+20, 鼓勵(lì)積極回帖 2019-08-11 15:21:03
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你是要做原核菌的同源重組嗎？我這兩天也剛查這方面的資料，簡(jiǎn)單說(shuō)一下我的見(jiàn)解，僅供交流。 三片段各自擴(kuò)增好后，先進(jìn)行連接，然后再把融合好的打靶片段通過(guò)TA克隆鏈接到載體上，轉(zhuǎn)入目的菌后進(jìn)行篩選就可以。 大體流程是這樣，說(shuō)著不難，但確實(shí)是做的過(guò)程中會(huì)有很多問(wèn)題。 你上面提到的疑惑，多片段和載體共同連接轉(zhuǎn)化后，沒(méi)什么單菌落，那可能是連接效率不太好。 另外，你挑了單克隆搖菌提質(zhì)粒，再雙酶切，是什么目的呢？連上了為什么又要切開(kāi)？ 最后，你所謂的陰性對(duì)照1只加了載體，你指的是線性化的載體嗎？那不應(yīng)該會(huì)長(zhǎng)菌啊。如果是空載，是會(huì)有正常菌落的。 陰性對(duì)照2是加入了三個(gè)基因片段，理論上也不會(huì)長(zhǎng)菌啊，為什么你的也有呢？ |
5樓2019-08-06 15:42:27
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