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小千100新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
同源重組多片段連接做不出來(lái)，我想重新做但又不知道是哪里操作的問(wèn)題，怎么改進(jìn)? 已有3人參與
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使用的是諾維贊多片段連接試劑盒，引物用公司的在線軟件設(shè)計(jì)的。載體8000多bp，三個(gè)片段分別1019，381，250多。 1.載體用takara快切酶雙酶切30min，切膠回收，目的片段分別以之前的2個(gè)T載體擴(kuò)增，一個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)增，切膠回收。 2.分別稀釋跑膠估算載體、三個(gè)片段濃度，按片段長(zhǎng)度計(jì)算大致每個(gè)片段需要多少ng，加入多少μl 3.按說(shuō)明書(shū)分別加入4μl載體，三個(gè)片段2μl，1μl，1μl，酶和buffer分別2μl，4μl，總體積20μl。37度反應(yīng)30min。 4.10μl重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μl大腸桿菌感受態(tài)，過(guò)夜培養(yǎng)挑單菌落（比較少） 5.挑了9個(gè)單菌落搖菌提了質(zhì)粒，雙酶切都沒(méi)有切出片段。 6.同時(shí)我做了兩個(gè)陰性對(duì)照1和2，都長(zhǎng)了很多單菌落。1是只加了載體4μl，加水至20μl.2是只加了三個(gè)片段，加水至20μl. @wizardfan @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
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是的，我覺(jué)得有時(shí)候碰運(yùn)氣，后面我重復(fù)了就連成了，具體哪里問(wèn)題我也不清楚。還有一個(gè)問(wèn)題就是我其中一個(gè)酶切位點(diǎn)上下游GC含量偏低，沒(méi)達(dá)到說(shuō)明書(shū)中的40%-60%之間。這個(gè)應(yīng)該也是一個(gè)因素影響連接效率，總之嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)的來(lái)應(yīng)該不會(huì)錯(cuò)的。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
8樓2019-08-06 19:14:38
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2樓2019-07-24 10:02:34
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西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2019-07-24 18:02:51
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| 有一個(gè)問(wèn)題呀，你的陰性對(duì)照不加片段或者載體應(yīng)該不會(huì)形成環(huán)狀質(zhì)粒，怎么會(huì)長(zhǎng)出菌落呢？另外，你可以試一下將三個(gè)片段通過(guò)PCR連接起來(lái)再克隆到載體上。諾唯贊來(lái)我們這推銷(xiāo)過(guò)這個(gè)試劑盒，我覺(jué)得沒(méi)有什么優(yōu)勢(shì)，即使你現(xiàn)在克隆上了，還是要切下來(lái)，再進(jìn)行后續(xù)的酶切連接，并沒(méi)有省事。個(gè)人建議。 |
3樓2019-07-24 12:13:01
匿名
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4樓2019-07-27 18:40:00
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