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ylian0

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[交流] qPCR標(biāo)曲正常，但是結(jié)果比理論值高1~2個(gè)數(shù)量級(jí)，求大家?guī)兔Ψ治鲈颉?

大家好，我這邊最近做qPCR絕對(duì)定量遇到一個(gè)現(xiàn)象，就是qPCR的結(jié)果和我的菌液鏡檢結(jié)果相差1~2個(gè)數(shù)量級(jí)，下面把結(jié)果和實(shí)驗(yàn)中的一些參數(shù)給大家看看，請(qǐng)幫忙分析一下。
我的qPCR結(jié)果顯示我菌液濃度約為8E+11copies/ml，顯微鏡檢結(jié)果約為3E+9個(gè)/ml。
由于不確定細(xì)菌基因拷貝數(shù)，假如拷貝數(shù)為10，qPCR的結(jié)果仍然是8E+10 cell/ml，還是比顯微鏡檢高了1個(gè)數(shù)量級(jí)。
雖然顯微鏡檢也是相對(duì)定量，結(jié)果有與實(shí)際值有偏差，但是10倍差在顯微鏡下差異還是很大的。

我是提取的質(zhì)粒DNA，用qubit測(cè)的濃度為84ng/μl，目的片段堿基數(shù)分別為A:T:C:G=59:50:73:95（合計(jì)277），質(zhì)粒用的pMD-19T堿基數(shù)A:T:C:G=662：:69:676:686（合計(jì)2693），計(jì)算公式為：標(biāo)品拷貝數(shù)=84x(6.02E+23)/(277+2693)/660，質(zhì)粒標(biāo)品濃度為2.58E+10 copies/μl，質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋取2~8次方進(jìn)行qPCR檢測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)：擴(kuò)增效率90.6%，R2=0.999，slope=-3.571
溶劑曲線：?jiǎn)畏澹瑹o(wú)非特異性擴(kuò)增

樣品DNA稀釋100倍進(jìn)行qPCR檢測(cè)，下機(jī)拷貝數(shù)為：1.56E+7 copies/μl
用0.2ml菌液離心洗滌，400μl重懸破壁后取上清200μl提DNA，50μl去離子水洗脫，
DNA拷貝數(shù)計(jì)算公式為：菌液DNA含量（copies/ml）=（1.56E+7）x100x50x2/0.2，結(jié)果約為8E+11copies/ml

小木蟲(chóng)今天沒(méi)法上傳圖片，只能辛苦大家看文字版了，謝謝！

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1樓 2020-11-20 15:50:28

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junjieshao

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4樓2020-11-20 23:44:04

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mariahit

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1樓: Originally posted by ylian0 at 2020-11-20 15:50:28
大家好，我這邊最近做qPCR絕對(duì)定量遇到一個(gè)現(xiàn)象，就是qPCR的結(jié)果和我的菌液鏡檢結(jié)果相差1~2個(gè)數(shù)量級(jí)，下面把結(jié)果和實(shí)驗(yàn)中的一些參數(shù)給大家看看，請(qǐng)幫忙分析一下。
我的qPCR結(jié)果顯示我菌液濃度約為8E+11copies/ml， ...

最后沒(méi)明白為什么要乘以二，而且感覺(jué)應(yīng)該跟質(zhì)粒的拷貝數(shù)進(jìn)行比較吧，qpcr首次接觸，只是個(gè)人觀點(diǎn)

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14樓2020-11-21 23:47:01

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Taqman-

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17樓2020-11-22 22:44:59

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ylian0

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14樓: Originally posted by mariahit at 2020-11-21 23:47:01
最后沒(méi)明白為什么要乘以二，而且感覺(jué)應(yīng)該跟質(zhì)粒的拷貝數(shù)進(jìn)行比較吧，qpcr首次接觸，只是個(gè)人觀點(diǎn)
...

乘以2是因?yàn)樵谔酓NA的過(guò)程中，只取了混合菌液一半的液體進(jìn)行提DNA操作，我們用的beads破壁，不是所有重懸菌液都能用于提DNA。

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25樓2020-11-26 09:21:41

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angkuLC

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25樓: Originally posted by ylian0 at 2020-11-26 09:21:41
乘以2是因?yàn)樵谔酓NA的過(guò)程中，只取了混合菌液一半的液體進(jìn)行提DNA操作，我們用的beads破壁，不是所有重懸菌液都能用于提DNA。...

請(qǐng)問(wèn)樓主“beads破壁，不是所有重懸菌液都能用于提DNA”是什么意思呢？

個(gè)人感覺(jué)解決方法有：1. 如果不知道混合菌液的物種可以做下高通量，然后把含量較高的幾個(gè)物種所含基因的拷貝數(shù)算下；如果知道就直接算拷貝數(shù)。2. 測(cè)混合菌液OD值估算量級(jí)。3. 排除下顯微鏡鏡檢的因素：是否只計(jì)數(shù)熒光細(xì)菌，如果是的話是否在培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)是否包含質(zhì)粒（或此段基因）進(jìn)行了篩選。按說(shuō)顯微鏡鏡檢應(yīng)該是最直接的方法。另外，Jeff Gore有幾篇文章是采用電鏡的方法計(jì)數(shù)，就是很燒錢……

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27樓2021-10-09 22:02:56

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你樣品提取完成后沒(méi)有測(cè)Dna濃度嗎，稀釋了一百倍都居然還有1E+7copies/ul那么高，CT值估計(jì)都快接近上限了

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29樓2023-08-23 13:55:44

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劉茯柚

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我最近也遇到這個(gè)問(wèn)題我在定量大腸桿菌基因組上的單拷貝數(shù)的基因結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因數(shù)比我加的大腸桿菌數(shù)量（稀釋涂板計(jì)算）還多一個(gè)數(shù)量級(jí) 心都碎了樓主最后找到原因了怎么解決的啊

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30樓2024-01-09 16:15:09

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0362180114

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不懂

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31樓2024-01-17 12:22:22

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三歲何啊

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我的都做不出來(lái)

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32樓2024-08-23 15:54:57

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簡(jiǎn)單回復(fù)

tzynew2樓

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xiaoqiuqiu203樓

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