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[交流]
qPCR標(biāo)曲正常，但是結(jié)果比理論值高1~2個數(shù)量級，求大家?guī)兔Ψ治鲈颉?
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大家好，我這邊最近做qPCR絕對定量遇到一個現(xiàn)象，就是qPCR的結(jié)果和我的菌液鏡檢結(jié)果相差1~2個數(shù)量級，下面把結(jié)果和實驗中的一些參數(shù)給大家看看，請幫忙分析一下。 我的qPCR結(jié)果顯示我菌液濃度約為8E+11copies/ml，顯微鏡檢結(jié)果約為3E+9個/ml。 由于不確定細(xì)菌基因拷貝數(shù)，假如拷貝數(shù)為10，qPCR的結(jié)果仍然是8E+10 cell/ml，還是比顯微鏡檢高了1個數(shù)量級。 雖然顯微鏡檢也是相對定量，結(jié)果有與實際值有偏差，但是10倍差在顯微鏡下差異還是很大的。 我是提取的質(zhì)粒DNA，用qubit測的濃度為84ng/μl，目的片段堿基數(shù)分別為A:T:C:G=59:50:73:95（合計277），質(zhì)粒用的pMD-19T堿基數(shù)A:T:C:G=662：:69:676:686（合計2693），計算公式為：標(biāo)品拷貝數(shù)=84x(6.02E+23)/(277+2693)/660，質(zhì)粒標(biāo)品濃度為2.58E+10 copies/μl，質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋取2~8次方進(jìn)行qPCR檢測。 標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)：擴(kuò)增效率90.6%，R2=0.999，slope=-3.571 溶劑曲線：單峰，無非特異性擴(kuò)增 樣品DNA稀釋100倍進(jìn)行qPCR檢測，下機(jī)拷貝數(shù)為：1.56E+7 copies/μl 用0.2ml菌液離心洗滌，400μl重懸破壁后取上清200μl提DNA，50μl去離子水洗脫， DNA拷貝數(shù)計算公式為：菌液DNA含量（copies/ml）=（1.56E+7）x100x50x2/0.2，結(jié)果約為8E+11copies/ml 小木蟲今天沒法上傳圖片，只能辛苦大家看文字版了，謝謝！ |
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30樓2024-01-09 16:15:09
junjieshao
禁蟲 (小有名氣)
★
ylian0(金幣+1): 謝謝參與
ylian0(金幣+1): 謝謝參與
|
本帖內(nèi)容被屏蔽 |
4樓2020-11-20 23:44:04
★
ylian0(金幣+1): 謝謝參與
ylian0(金幣+1): 謝謝參與
|
最后沒明白為什么要乘以二，而且感覺應(yīng)該跟質(zhì)粒的拷貝數(shù)進(jìn)行比較吧，qpcr首次接觸，只是個人觀點 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
14樓2020-11-21 23:47:01
簡單回復(fù)
icanspll5樓
2020-11-21 14:01
回復(fù)
ylian0(金幣+1): 謝謝參與
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zzhello6樓
2020-11-21 14:01
回復(fù)
ylian0(金幣+1): 謝謝參與
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yaqianye7樓
2020-11-21 14:01
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ylian0(金幣+1): 謝謝參與
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蓉蓉番薯8樓
2020-11-21 14:01
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ylian0(金幣+1): 謝謝參與
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2020-11-21 14:02
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ylian0(金幣+1): 謝謝參與
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Haibo_10樓
2020-11-21 14:04
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ylian0(金幣+1): 謝謝參與
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howtoge11樓
2020-11-21 14:05
回復(fù)
ylian0(金幣+1): 謝謝參與
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shehuifei12樓
2020-11-21 14:05
回復(fù)
ylian0(金幣+1): 謝謝參與
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gofast11213樓
2020-11-21 14:11
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ylian0(金幣+1): 謝謝參與
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