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[交流]
qPCR標(biāo)曲正常，但是結(jié)果比理論值高1~2個(gè)數(shù)量級，求大家?guī)兔Ψ治鲈颉?
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大家好，我這邊最近做qPCR絕對定量遇到一個(gè)現(xiàn)象，就是qPCR的結(jié)果和我的菌液鏡檢結(jié)果相差1~2個(gè)數(shù)量級，下面把結(jié)果和實(shí)驗(yàn)中的一些參數(shù)給大家看看，請幫忙分析一下。 我的qPCR結(jié)果顯示我菌液濃度約為8E+11copies/ml，顯微鏡檢結(jié)果約為3E+9個(gè)/ml。 由于不確定細(xì)菌基因拷貝數(shù)，假如拷貝數(shù)為10，qPCR的結(jié)果仍然是8E+10 cell/ml，還是比顯微鏡檢高了1個(gè)數(shù)量級。 雖然顯微鏡檢也是相對定量，結(jié)果有與實(shí)際值有偏差，但是10倍差在顯微鏡下差異還是很大的。 我是提取的質(zhì)粒DNA，用qubit測的濃度為84ng/μl，目的片段堿基數(shù)分別為A:T:C:G=59:50:73:95（合計(jì)277），質(zhì)粒用的pMD-19T堿基數(shù)A:T:C:G=662：:69:676:686（合計(jì)2693），計(jì)算公式為：標(biāo)品拷貝數(shù)=84x(6.02E+23)/(277+2693)/660，質(zhì)粒標(biāo)品濃度為2.58E+10 copies/μl，質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋取2~8次方進(jìn)行qPCR檢測。 標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)：擴(kuò)增效率90.6%，R2=0.999，slope=-3.571 溶劑曲線：單峰，無非特異性擴(kuò)增 樣品DNA稀釋100倍進(jìn)行qPCR檢測，下機(jī)拷貝數(shù)為：1.56E+7 copies/μl 用0.2ml菌液離心洗滌，400μl重懸破壁后取上清200μl提DNA，50μl去離子水洗脫， DNA拷貝數(shù)計(jì)算公式為：菌液DNA含量（copies/ml）=（1.56E+7）x100x50x2/0.2，結(jié)果約為8E+11copies/ml 小木蟲今天沒法上傳圖片，只能辛苦大家看文字版了，謝謝！ |
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junjieshao
禁蟲 (小有名氣)
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4樓2020-11-20 23:44:04
★
ylian0(金幣+1): 謝謝參與
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最后沒明白為什么要乘以二，而且感覺應(yīng)該跟質(zhì)粒的拷貝數(shù)進(jìn)行比較吧，qpcr首次接觸，只是個(gè)人觀點(diǎn) 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
14樓2020-11-21 23:47:01
17樓2020-11-22 22:44:59
25樓2020-11-26 09:21:41
★
ylian0(金幣+1): 謝謝參與
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請問樓主“beads破壁，不是所有重懸菌液都能用于提DNA”是什么意思呢？ 個(gè)人感覺解決方法有：1. 如果不知道混合菌液的物種可以做下高通量，然后把含量較高的幾個(gè)物種所含基因的拷貝數(shù)算下；如果知道就直接算拷貝數(shù)。2. 測混合菌液OD值估算量級。3. 排除下顯微鏡鏡檢的因素：是否只計(jì)數(shù)熒光細(xì)菌，如果是的話是否在培養(yǎng)過程中對是否包含質(zhì)粒（或此段基因）進(jìn)行了篩選。按說顯微鏡鏡檢應(yīng)該是最直接的方法。另外，Jeff Gore有幾篇文章是采用電鏡的方法計(jì)數(shù)，就是很燒錢…… |
27樓2021-10-09 22:02:56
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30樓2024-01-09 16:15:09
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32樓2024-08-23 15:54:57
簡單回復(fù)
tzynew2樓
2020-11-20 17:36
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2020-11-20 21:53
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icanspll5樓
2020-11-21 14:01
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zzhello6樓
2020-11-21 14:01
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yaqianye7樓
2020-11-21 14:01
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蓉蓉番薯8樓
2020-11-21 14:01
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2020-11-21 14:02
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Haibo_10樓
2020-11-21 14:04
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howtoge11樓
2020-11-21 14:05
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shehuifei12樓
2020-11-21 14:05
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gofast11213樓
2020-11-21 14:11
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下載電子書15樓
2020-11-22 08:17
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下載電子書16樓
2020-11-22 08:18
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nono200918樓
2020-11-23 07:07
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蘇州華博19樓
2020-11-23 15:19
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1
psylhh20樓
2020-11-23 22:44
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syhorchid21樓
2020-11-23 23:12
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蘇州華博22樓
2020-11-24 14:10
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miaojiabing23樓
2020-11-24 16:44
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1
下載電子書24樓
2020-11-24 20:41
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BiotageAB26樓
2020-12-01 10:39
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1
扯頭花28樓
2023-07-25 18:16
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