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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » Inverse—PCR
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Inverse—PCR 已有1人參與
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之前實驗室一直用inversespcr定位外緣插入片段，我們是做植物，最近一個月，一直做不出來，跑膠全是空白，酶以及其他試劑幾乎換了個遍，就是不行，大家有沒有遇到類似情況，求助！ @wizardfan @biostar2009 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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【答案】應助回帖
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首先 這類實驗你一定要確定不是技術問題， 最好的方法是 你找個做過inverse pcr的人帶你做 我以前也是做一個月做不出來 后來發(fā)現是酶壞了（被師弟放在室溫下太久了，變質了）。 后來發(fā)現pcr cycles溫度不太對（92-55-72）。 后來發(fā)現跑膠的染料變質，染不上去。 最后找個分子生物學專家?guī)兔Σ彭樌鉀Q。 你一定要找個曾經成功過的人帶你，而且要先確認你的所有材料都是好的，技術環(huán)節(jié)不出錯 其次 即使技術環(huán)節(jié)不出錯， inverse pcr這個技術本身， 也未必可以成功。 這個純粹看運氣， 你定位插入的地方， 如果距離切割（限制性內切酶）的地方太遠， 比如2w個base pairs（有點夸張的比喻）， 那你肯定pcr不成。 這種情況要做full genome sequence，燒錢是唯一的辦法。 |
4樓2020-07-30 09:24:53
【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數 +1
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首先 這類實驗你一定要確定不是技術問題， 最好的方法是 你找個做過inverse pcr的人帶你做 我以前也是做一個月做不出來 后來發(fā)現是酶壞了（被師弟放在室溫下太久了，變質了）。 后來發(fā)現pcr cycles溫度不太對（92-55-72）。 后來發(fā)現跑膠的染料變質，染不上去。 最后找個分子生物學專家?guī)兔Σ彭樌鉀Q。 你一定要找個曾經成功過的人帶你，而且要先確認你的所有材料都是好的，技術環(huán)節(jié)不出錯 其次 即使技術環(huán)節(jié)不出錯， inverse pcr這個技術本身， 也未必可以成功。 這個純粹看運氣， 你定位插入的地方， 如果距離切割（限制性內切酶）的地方太遠， 比如2w個base pairs（有點夸張的比喻）， 那你肯定pcr不成。 這種情況要做full genome sequence，燒錢是唯一的辦法。 |
2樓2020-07-30 09:21:39
3樓2020-07-30 09:24:22
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謝謝回答，不是很會用小木蟲，抱歉才看到，整個體系之前實驗室做了一年，非常成熟，師兄帶我做的，后來師兄畢業(yè)了，我們是做很多獨立樣品，而且是四堿基酶，所以做一次二十多個樣品，如果成功的話不會一個也做不出來，各種試劑沒有問題，酶和引物都用新的，循環(huán)我也用的55度，我還會進行二次循環(huán)，用58度，最近一直在做，還是不行，有點氣餒了 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
5樓2020-12-24 22:26:39
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