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【求助】ChIP超聲效果檢驗的解交聯問題/DNA彌散片段集中于5000bp
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大家好，剛接觸ChIP，遇到了比較疑惑的（猜測可能是）解交聯的問題，希望大家能給予指導，先說聲謝謝！ 年前預實驗交聯（1%甲醛，5-10min）、超聲（bioruptor plus-high-30s on/off-薄壁管）、解交聯消化（65度0.25M Nacl振搖過夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）、純化DNA，有得到我們認為比較好的電泳結果，如圖1所示。 【問題來了！  】正打算進一步確定最佳的交聯時間和超聲數的時候，出現了圖2的電泳結果（DNA不彌散了集中在5000bp，感覺是基因組DNA的位置）。于是陸續(xù)更換了甲醛、Nacl、蛋白酶K、RNAse，還參考論壇上的解交聯條件變化了一下解交聯和消化的順序……換了新買的蛋白酶K之后，膠圖終于有了一點變化，但主條帶還是沒有下來：請看圖2。 舊樣品里的H-25是第一張圖的#7(之前解交聯電泳結果不錯的，取了-80凍的超聲樣品重新解交聯），考慮到①H-25這個結果； ②25/30 cycle已經是一個比較長的超聲時間了，12.5/15min，和文獻中的也差不多； ③超聲循環(huán)數的增加并沒有使DNA條帶發(fā)生一點點下移； ④lab另一位同學也做chip，他ip的不是TF所以直接用了SDS lysis buffer（1%SDS，我的sonication buffer里的SDS是0.1%）和國產的超聲儀器（不記得型號了），其他試劑（甲醛、甘氨酸、Nacl、RNAse、蛋白酶K）都用的我的，順利得到了理想的片段化基因。 所以我們更偏向認為是超聲之后的步驟發(fā)生問題，但試劑基本換過了，實在排除不出原因。只好來論壇求助，有沒有做過chip的大神能看出哪里出問題呢…… 補充： 1.buffer配方：因為想要IP的是轉錄因子，所以當時和師兄參考了文獻之后，決定自己配制比較溫和的buffer（一直放在4度，使用前現加cocktail），配方如下： lysis buffer I (50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, protease inhibitors) lysis buffer II (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mMEDTA, 0.5 mM EGTA, protease inhibitors) sonication buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS, and 1% Triton X-100, protease inhibitors) 2.目前的解交聯條件是：37 ℃ RNAse 1h，65 ℃ 0.2mM Nacl+蛋白酶K 靜置過夜，酚氯仿異戊醇純化DNA。上圖最右測是分別不加蛋白酶K、不解交聯、不加RNAse想看有啥影響，發(fā)現好像沒啥影響，更疑惑了……更迷的是，不加蛋白酶K的效果反而更好。。總不會是蛋白酶K把DNA鎖在那了吧，可DNA純化應該也去掉了啊。。 3.之所以更改解交聯的流程，一方面參考了其他人的步驟，另一方面是因為自己原本的protocol（65度0.25M Nacl振搖過夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）65度過夜之后會出現小白片、片狀沉淀，加了蛋白酶K之后消失。自己年前預實驗的時候沒有注意是否有這個現象，問了其他人沒有這個高溫析出蛋白的情況；不知道是否預示著哪里出了問題？ 4.比對了buffer的成分，其實和常用的也挺像，感覺就是濃度低一些，按理說放四度不會有啥變化啊，可也沒有別的東西能懷疑了。有沒有朋友可以支支招？ 大家有任何建議或提示都請評論，我先謝為敬�。。� |
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2樓2020-05-30 09:32:51
3樓2020-05-30 11:38:58
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猜測，轉錄因子是屬于瞬時轉染，同一批樣品一個先做一個后做，交聯和破碎的時間可能就需要重新摸索下，我們前面做就出現過這樣情況，先摸索出的條件在做同一批低溫保存了的樣品就不行 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2020-06-01 17:06:37
5樓2020-06-02 00:57:04
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大家好，之前老師建議我先往后做IP，做了一次感覺data沒有用，做一次挺費抗體的，還是回來摸條件了。 前面敘述中有提到我的裂解液是自己配的，兩步裂解之后還要更換自配的超聲buffer（0.1%SDS，一共三個buffer）。然后，同學用的裂解液就是最常用的SDS lysis buffer【1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.1)】。我分別用了自己的三步裂解液和同學的裂解液、Bioruptor plus和實驗室的國產超聲儀。結果如下： 鏈接: https://pan.baidu.com/s/1dAoSHIz5pjDoxodLbRas-w 提取碼: cevv 復制這段內容后打開百度網盤手機App，操作更方便哦 換了buffer之后就打下來了，而且片段化基因完全符合后續(xù)實驗要求，說明自己的三步buffer的確出了問題。 但還有兩個疑點： ①如何解釋之前解交聯成功的超聲樣品，無法再次解交聯？是否凍存的已超聲樣品中的超聲buffer某些成分也同步變質使其交聯無法逆轉？ ②這次超聲cycle對應的是30cycle，之前用自己的buffer在20、25就可以得到更小的片段，難道一開始并沒有真的打斷DNA？不過也有可能是因為細胞密度不同。 所以，我下一步打算用新配的超聲buffer試一下，如果可以，就立即盡快把解交聯實驗做完，避免樣品受超聲buffer影響。如果新配的超聲buffer不行，跟導師商量一下是不是用1%SDS lysis buffer試試。之前是擔心1%SDS會使轉錄因子的結合位點變性，影響結合；本來結合就比較弱，擔心檢測不到信號。有沒有做過轉錄因子ChIP的大佬可以在lysis buffer上給點建議呢？ |
6樓2020-06-02 01:22:27
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更新一下，最早之所以用了自己配的配方復雜的裂解液是因為ChIP做的是Tfs，怕kit自帶的1% SDS buffer太強。 后來，一樓說的問題解決了，應該是自己配的裂解液失效了，具體原因不明，反正重新配了，超聲的膠圖就不會出現基因組條帶了。 具體的protocol后來也是用的最簡單的，和碧云天kit差不多的配方。具體的分享一下： 甲醛交聯：0.8% formaldehyde 7min 裂解液：0.2% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.1) 存于室溫 超聲條件：Bioruptor (Diagenode) with 30 s on and 30 s off at 4℃ on a high power output for 17~18 cycles 5 M NaCl解交聯： 65°C旋轉孵育>4hr/過夜 2 μl Proteinase K（20mg/ml，碧云天）65°C孵育1 h（正式ChIP樣品是500ul體系：加10ul 0.5M EDTA，20ul 1M tris-HCl（pH6.5），2ul蛋白酶K） 至于之前說的小白片的問題，我是先解交聯再加蛋白酶K，而師姐是兩步一起做的所以沒看到小白片。個人猜測是解交聯之后析出的蛋白，加完蛋白酶K消化完自然就消失了。 再者就是，除了ChIP-qPCR檢測，用qUBIT也能明顯看出有沒有拉下來DNA，nanodrop測DNA濃度的精度不夠。 |
7樓2022-03-23 09:57:59
atikou
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8樓2022-03-27 14:44:58
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