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豬妹妹May鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
【求助】ChIP超聲效果檢驗(yàn)的解交聯(lián)問(wèn)題/DNA彌散片段集中于5000bp
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大家好，剛接觸ChIP，遇到了比較疑惑的（猜測(cè)可能是）解交聯(lián)的問(wèn)題，希望大家能給予指導(dǎo)，先說(shuō)聲謝謝！ 年前預(yù)實(shí)驗(yàn)交聯(lián)（1%甲醛，5-10min）、超聲（bioruptor plus-high-30s on/off-薄壁管）、解交聯(lián)消化（65度0.25M Nacl振搖過(guò)夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）、純化DNA，有得到我們認(rèn)為比較好的電泳結(jié)果，如圖1所示。 【問(wèn)題來(lái)了！  】正打算進(jìn)一步確定最佳的交聯(lián)時(shí)間和超聲數(shù)的時(shí)候，出現(xiàn)了圖2的電泳結(jié)果（DNA不彌散了集中在5000bp，感覺(jué)是基因組DNA的位置）。于是陸續(xù)更換了甲醛、Nacl、蛋白酶K、RNAse，還參考論壇上的解交聯(lián)條件變化了一下解交聯(lián)和消化的順序……換了新買(mǎi)的蛋白酶K之后，膠圖終于有了一點(diǎn)變化，但主條帶還是沒(méi)有下來(lái)：請(qǐng)看圖2。 舊樣品里的H-25是第一張圖的#7(之前解交聯(lián)電泳結(jié)果不錯(cuò)的，取了-80凍的超聲樣品重新解交聯(lián)），考慮到①H-25這個(gè)結(jié)果； ②25/30 cycle已經(jīng)是一個(gè)比較長(zhǎng)的超聲時(shí)間了，12.5/15min，和文獻(xiàn)中的也差不多； ③超聲循環(huán)數(shù)的增加并沒(méi)有使DNA條帶發(fā)生一點(diǎn)點(diǎn)下移； ④lab另一位同學(xué)也做chip，他ip的不是TF所以直接用了SDS lysis buffer（1%SDS，我的sonication buffer里的SDS是0.1%）和國(guó)產(chǎn)的超聲儀器（不記得型號(hào)了），其他試劑（甲醛、甘氨酸、Nacl、RNAse、蛋白酶K）都用的我的，順利得到了理想的片段化基因。 所以我們更偏向認(rèn)為是超聲之后的步驟發(fā)生問(wèn)題，但試劑基本換過(guò)了，實(shí)在排除不出原因。只好來(lái)論壇求助，有沒(méi)有做過(guò)chip的大神能看出哪里出問(wèn)題呢…… 補(bǔ)充： 1.buffer配方：因?yàn)橄胍狪P的是轉(zhuǎn)錄因子，所以當(dāng)時(shí)和師兄參考了文獻(xiàn)之后，決定自己配制比較溫和的buffer（一直放在4度，使用前現(xiàn)加cocktail），配方如下： lysis buffer I (50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, protease inhibitors) lysis buffer II (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mMEDTA, 0.5 mM EGTA, protease inhibitors) sonication buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS, and 1% Triton X-100, protease inhibitors) 2.目前的解交聯(lián)條件是：37 ℃ RNAse 1h，65 ℃ 0.2mM Nacl+蛋白酶K 靜置過(guò)夜，酚氯仿異戊醇純化DNA。上圖最右測(cè)是分別不加蛋白酶K、不解交聯(lián)、不加RNAse想看有啥影響，發(fā)現(xiàn)好像沒(méi)啥影響，更疑惑了……更迷的是，不加蛋白酶K的效果反而更好。�？偛粫�(huì)是蛋白酶K把DNA鎖在那了吧，可DNA純化應(yīng)該也去掉了啊。。 3.之所以更改解交聯(lián)的流程，一方面參考了其他人的步驟，另一方面是因?yàn)樽约涸镜膒rotocol（65度0.25M Nacl振搖過(guò)夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）65度過(guò)夜之后會(huì)出現(xiàn)小白片、片狀沉淀，加了蛋白酶K之后消失。自己年前預(yù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候沒(méi)有注意是否有這個(gè)現(xiàn)象，問(wèn)了其他人沒(méi)有這個(gè)高溫析出蛋白的情況；不知道是否預(yù)示著哪里出了問(wèn)題？ 4.比對(duì)了buffer的成分，其實(shí)和常用的也挺像，感覺(jué)就是濃度低一些，按理說(shuō)放四度不會(huì)有啥變化啊，可也沒(méi)有別的東西能懷疑了。有沒(méi)有朋友可以支支招？ 大家有任何建議或提示都請(qǐng)?jiān)u論，我先謝為敬！��！ |
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豬妹妹May
鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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更新一下，最早之所以用了自己配的配方復(fù)雜的裂解液是因?yàn)镃hIP做的是Tfs，怕kit自帶的1% SDS buffer太強(qiáng)。 后來(lái)，一樓說(shuō)的問(wèn)題解決了，應(yīng)該是自己配的裂解液失效了，具體原因不明，反正重新配了，超聲的膠圖就不會(huì)出現(xiàn)基因組條帶了。 具體的protocol后來(lái)也是用的最簡(jiǎn)單的，和碧云天kit差不多的配方。具體的分享一下： 甲醛交聯(lián)：0.8% formaldehyde 7min 裂解液：0.2% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.1) 存于室溫 超聲條件：Bioruptor (Diagenode) with 30 s on and 30 s off at 4℃ on a high power output for 17~18 cycles 5 M NaCl解交聯(lián)： 65°C旋轉(zhuǎn)孵育>4hr/過(guò)夜 2 μl Proteinase K（20mg/ml，碧云天）65°C孵育1 h（正式ChIP樣品是500ul體系：加10ul 0.5M EDTA，20ul 1M tris-HCl（pH6.5），2ul蛋白酶K） 至于之前說(shuō)的小白片的問(wèn)題，我是先解交聯(lián)再加蛋白酶K，而師姐是兩步一起做的所以沒(méi)看到小白片。個(gè)人猜測(cè)是解交聯(lián)之后析出的蛋白，加完蛋白酶K消化完自然就消失了。 再者就是，除了ChIP-qPCR檢測(cè)，用qUBIT也能明顯看出有沒(méi)有拉下來(lái)DNA，nanodrop測(cè)DNA濃度的精度不夠。 |
7樓2022-03-23 09:57:59
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片段打不下去，只可能和交聯(lián)時(shí)間和超聲破碎這兩個(gè)有問(wèn)題吧，和其他因素關(guān)系不大吧 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
2樓2020-05-30 09:32:51
豬妹妹May
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您好，這個(gè)超聲和交聯(lián)條件之前已經(jīng)打下來(lái)片段的，在圖1。用之前超聲效果OK的超聲樣品重新拿去解交聯(lián)、純化也解不出來(lái)了。 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
3樓2020-05-30 11:38:58
mooun
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猜測(cè)，轉(zhuǎn)錄因子是屬于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，同一批樣品一個(gè)先做一個(gè)后做，交聯(lián)和破碎的時(shí)間可能就需要重新摸索下，我們前面做就出現(xiàn)過(guò)這樣情況，先摸索出的條件在做同一批低溫保存了的樣品就不行 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
4樓2020-06-01 17:06:37
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