 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 5462 | 回復(fù): 7 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
豬妹妹May鐵蟲 (初入文壇)
|
[求助]
【求助】ChIP超聲效果檢驗(yàn)的解交聯(lián)問題/DNA彌散片段集中于5000bp
|
||
|
大家好，剛接觸ChIP，遇到了比較疑惑的（猜測可能是）解交聯(lián)的問題，希望大家能給予指導(dǎo)，先說聲謝謝！ 年前預(yù)實(shí)驗(yàn)交聯(lián)（1%甲醛，5-10min）、超聲（bioruptor plus-high-30s on/off-薄壁管）、解交聯(lián)消化（65度0.25M Nacl振搖過夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）、純化DNA，有得到我們認(rèn)為比較好的電泳結(jié)果，如圖1所示。 【問題來了！  】正打算進(jìn)一步確定最佳的交聯(lián)時間和超聲數(shù)的時候，出現(xiàn)了圖2的電泳結(jié)果（DNA不彌散了集中在5000bp，感覺是基因組DNA的位置）。于是陸續(xù)更換了甲醛、Nacl、蛋白酶K、RNAse，還參考論壇上的解交聯(lián)條件變化了一下解交聯(lián)和消化的順序……換了新買的蛋白酶K之后，膠圖終于有了一點(diǎn)變化，但主條帶還是沒有下來：請看圖2。 舊樣品里的H-25是第一張圖的#7(之前解交聯(lián)電泳結(jié)果不錯的，取了-80凍的超聲樣品重新解交聯(lián)），考慮到①H-25這個結(jié)果； ②25/30 cycle已經(jīng)是一個比較長的超聲時間了，12.5/15min，和文獻(xiàn)中的也差不多； ③超聲循環(huán)數(shù)的增加并沒有使DNA條帶發(fā)生一點(diǎn)點(diǎn)下移； ④lab另一位同學(xué)也做chip，他ip的不是TF所以直接用了SDS lysis buffer（1%SDS，我的sonication buffer里的SDS是0.1%）和國產(chǎn)的超聲儀器（不記得型號了），其他試劑（甲醛、甘氨酸、Nacl、RNAse、蛋白酶K）都用的我的，順利得到了理想的片段化基因。 所以我們更偏向認(rèn)為是超聲之后的步驟發(fā)生問題，但試劑基本換過了，實(shí)在排除不出原因。只好來論壇求助，有沒有做過chip的大神能看出哪里出問題呢…… 補(bǔ)充： 1.buffer配方：因?yàn)橄胍狪P的是轉(zhuǎn)錄因子，所以當(dāng)時和師兄參考了文獻(xiàn)之后，決定自己配制比較溫和的buffer（一直放在4度，使用前現(xiàn)加cocktail），配方如下： lysis buffer I (50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, protease inhibitors) lysis buffer II (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mMEDTA, 0.5 mM EGTA, protease inhibitors) sonication buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS, and 1% Triton X-100, protease inhibitors) 2.目前的解交聯(lián)條件是：37 ℃ RNAse 1h，65 ℃ 0.2mM Nacl+蛋白酶K 靜置過夜，酚氯仿異戊醇純化DNA。上圖最右測是分別不加蛋白酶K、不解交聯(lián)、不加RNAse想看有啥影響，發(fā)現(xiàn)好像沒啥影響，更疑惑了……更迷的是，不加蛋白酶K的效果反而更好。�？偛粫堑鞍酌窴把DNA鎖在那了吧，可DNA純化應(yīng)該也去掉了啊。。 3.之所以更改解交聯(lián)的流程，一方面參考了其他人的步驟，另一方面是因?yàn)樽约涸镜膒rotocol（65度0.25M Nacl振搖過夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）65度過夜之后會出現(xiàn)小白片、片狀沉淀，加了蛋白酶K之后消失。自己年前預(yù)實(shí)驗(yàn)的時候沒有注意是否有這個現(xiàn)象，問了其他人沒有這個高溫析出蛋白的情況；不知道是否預(yù)示著哪里出了問題？ 4.比對了buffer的成分，其實(shí)和常用的也挺像，感覺就是濃度低一些，按理說放四度不會有啥變化啊，可也沒有別的東西能懷疑了。有沒有朋友可以支支招？ 大家有任何建議或提示都請?jiān)u論，我先謝為敬�。�！ |
回復(fù)此樓» 本帖附件資源列表
-
歡迎監(jiān)督和反饋：小木蟲僅提供交流平臺，不對該內(nèi)容負(fù)責(zé)。
本內(nèi)容由用戶自主發(fā)布，如果其內(nèi)容涉及到知識產(chǎn)權(quán)問題，其責(zé)任在于用戶本人，如對版權(quán)有異議，請聯(lián)系郵箱：xiaomuchong@tal.com - 附件 1 : 1.png
- 附件 2 : 2.png
- 附件 3 : 3.png
2020-05-30 02:46:58, 232.99 K
2020-05-30 02:46:59, 190.79 K
2020-05-30 02:46:59, 265.6 K
» 猜你喜歡
推薦一些20種氨基酸檢測的實(shí)際應(yīng)用案例
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有227人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
mooun
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 107.4
- 帖子: 37
- 在線: 6.6小時
- 蟲號: 14492040
- 注冊: 2019-03-05
- 專業(yè): 實(shí)驗(yàn)動物學(xué)
|
猜測，轉(zhuǎn)錄因子是屬于瞬時轉(zhuǎn)染，同一批樣品一個先做一個后做，交聯(lián)和破碎的時間可能就需要重新摸索下，我們前面做就出現(xiàn)過這樣情況，先摸索出的條件在做同一批低溫保存了的樣品就不行 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2020-06-01 17:06:37
0o向日葵o0
新蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1999.1
- 散金: 50
- 紅花: 2
- 沙發(fā): 2
- 帖子: 913
- 在線: 156.9小時
- 蟲號: 2369477
- 注冊: 2013-03-22
- 專業(yè): 植物病理學(xué)
2樓2020-05-30 09:32:51
豬妹妹May
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 44.3
- 帖子: 30
- 在線: 8.3小時
- 蟲號: 4726009
- 注冊: 2016-05-26
- 專業(yè): 細(xì)胞增殖、生長與分化
|
您好，這個超聲和交聯(lián)條件之前已經(jīng)打下來片段的，在圖1。用之前超聲效果OK的超聲樣品重新拿去解交聯(lián)、純化也解不出來了。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2020-05-30 11:38:58
豬妹妹May
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 44.3
- 帖子: 30
- 在線: 8.3小時
- 蟲號: 4726009
- 注冊: 2016-05-26
- 專業(yè): 細(xì)胞增殖、生長與分化
5樓2020-06-02 00:57:04
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 322分 085600求調(diào)劑，有互聯(lián)網(wǎng)+國金及主持省級大創(chuàng)經(jīng)歷 +5 | 熊境喆 2026-03-04 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 一志愿中石油，化學(xué)工程，301求調(diào)劑 +3 | 豚饅枳枳 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
[考研] 080500材料科學(xué)與工程 +7 | 202114020319 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085600材料調(diào)劑 總分330 +3 | 池池丶 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿中科大080500總分324求調(diào)劑 +3 | jorna 2026-03-03 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +3 | 李LJR 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085601 材料305分求助 +4 | 泡泡郵件 2026-03-03 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 322,求調(diào)劑 +3 | 菜菜愛玩 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +3 | Y?l?h 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[論文投稿]
EST拒稿重投
 5+3
|
15102603076 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境調(diào)劑 +8 | chenhanheng 2026-03-02 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 材料工程求調(diào)劑 +3 | 1431251 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +7 | repeatt?t 2026-02-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)，材料，環(huán)境類求調(diào)劑 +7 | 考研版棒棒 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 306分材料調(diào)劑 +5 | chuanzhu川燭 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿華南理工大學(xué)材料與化工326分，求調(diào)劑 +3 | wujinrui1 2026-02-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0856化工專碩求調(diào)劑 +15 | 董boxing 2026-03-01 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +5 | 2026計(jì)算機(jī)_誠心 2026-03-01 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 291分工科求調(diào)劑 +9 | science餓餓 2026-03-01 | 10/500 |
|
|
|
[論文投稿]
Optics letters投稿被拒求助
30+3
|
luckyry 2026-02-26 | 4/200 |
|