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豬妹妹May鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
【求助】ChIP超聲效果檢驗(yàn)的解交聯(lián)問題/DNA彌散片段集中于5000bp
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大家好，剛接觸ChIP，遇到了比較疑惑的（猜測(cè)可能是）解交聯(lián)的問題，希望大家能給予指導(dǎo)，先說聲謝謝！ 年前預(yù)實(shí)驗(yàn)交聯(lián)（1%甲醛，5-10min）、超聲（bioruptor plus-high-30s on/off-薄壁管）、解交聯(lián)消化（65度0.25M Nacl振搖過夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）、純化DNA，有得到我們認(rèn)為比較好的電泳結(jié)果，如圖1所示。 【問題來了！  】正打算進(jìn)一步確定最佳的交聯(lián)時(shí)間和超聲數(shù)的時(shí)候，出現(xiàn)了圖2的電泳結(jié)果（DNA不彌散了集中在5000bp，感覺是基因組DNA的位置）。于是陸續(xù)更換了甲醛、Nacl、蛋白酶K、RNAse，還參考論壇上的解交聯(lián)條件變化了一下解交聯(lián)和消化的順序……換了新買的蛋白酶K之后，膠圖終于有了一點(diǎn)變化，但主條帶還是沒有下來：請(qǐng)看圖2。 舊樣品里的H-25是第一張圖的#7(之前解交聯(lián)電泳結(jié)果不錯(cuò)的，取了-80凍的超聲樣品重新解交聯(lián)），考慮到①H-25這個(gè)結(jié)果； ②25/30 cycle已經(jīng)是一個(gè)比較長(zhǎng)的超聲時(shí)間了，12.5/15min，和文獻(xiàn)中的也差不多； ③超聲循環(huán)數(shù)的增加并沒有使DNA條帶發(fā)生一點(diǎn)點(diǎn)下移； ④lab另一位同學(xué)也做chip，他ip的不是TF所以直接用了SDS lysis buffer（1%SDS，我的sonication buffer里的SDS是0.1%）和國(guó)產(chǎn)的超聲儀器（不記得型號(hào)了），其他試劑（甲醛、甘氨酸、Nacl、RNAse、蛋白酶K）都用的我的，順利得到了理想的片段化基因。 所以我們更偏向認(rèn)為是超聲之后的步驟發(fā)生問題，但試劑基本換過了，實(shí)在排除不出原因。只好來論壇求助，有沒有做過chip的大神能看出哪里出問題呢…… 補(bǔ)充： 1.buffer配方：因?yàn)橄胍狪P的是轉(zhuǎn)錄因子，所以當(dāng)時(shí)和師兄參考了文獻(xiàn)之后，決定自己配制比較溫和的buffer（一直放在4度，使用前現(xiàn)加cocktail），配方如下： lysis buffer I (50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, protease inhibitors) lysis buffer II (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mMEDTA, 0.5 mM EGTA, protease inhibitors) sonication buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS, and 1% Triton X-100, protease inhibitors) 2.目前的解交聯(lián)條件是：37 ℃ RNAse 1h，65 ℃ 0.2mM Nacl+蛋白酶K 靜置過夜，酚氯仿異戊醇純化DNA。上圖最右測(cè)是分別不加蛋白酶K、不解交聯(lián)、不加RNAse想看有啥影響，發(fā)現(xiàn)好像沒啥影響，更疑惑了……更迷的是，不加蛋白酶K的效果反而更好。。總不會(huì)是蛋白酶K把DNA鎖在那了吧，可DNA純化應(yīng)該也去掉了啊。。 3.之所以更改解交聯(lián)的流程，一方面參考了其他人的步驟，另一方面是因?yàn)樽约涸镜膒rotocol（65度0.25M Nacl振搖過夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）65度過夜之后會(huì)出現(xiàn)小白片、片狀沉淀，加了蛋白酶K之后消失。自己年前預(yù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候沒有注意是否有這個(gè)現(xiàn)象，問了其他人沒有這個(gè)高溫析出蛋白的情況；不知道是否預(yù)示著哪里出了問題？ 4.比對(duì)了buffer的成分，其實(shí)和常用的也挺像，感覺就是濃度低一些，按理說放四度不會(huì)有啥變化啊，可也沒有別的東西能懷疑了。有沒有朋友可以支支招？ 大家有任何建議或提示都請(qǐng)?jiān)u論，我先謝為敬�。�！ |
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您好，這個(gè)超聲和交聯(lián)條件之前已經(jīng)打下來片段的，在圖1。用之前超聲效果OK的超聲樣品重新拿去解交聯(lián)、純化也解不出來了。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2020-05-30 11:38:58
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猜測(cè)，轉(zhuǎn)錄因子是屬于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，同一批樣品一個(gè)先做一個(gè)后做，交聯(lián)和破碎的時(shí)間可能就需要重新摸索下，我們前面做就出現(xiàn)過這樣情況，先摸索出的條件在做同一批低溫保存了的樣品就不行 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2020-06-01 17:06:37
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