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coostudent銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
2kb片段插入總是失敗，搞了半年了，求前輩拯救
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2kb片段插入質(zhì)粒xbaI位點(diǎn)，酶切酶連還有in-fusion的方法都試過了，但是最終挑不到陽性克隆。搞了半年了，感覺就是個(gè)簡單的酶切酶連操作，但就是搞不定，心累，想哭，求拯救！ 除了質(zhì)粒，相關(guān)的材料都換過了。質(zhì)粒也對酶切位點(diǎn)周圍測了序，沒有問題，理論上也不會(huì)發(fā)生甲基化…… 質(zhì)粒是鏈霉菌基因編輯的商業(yè)化質(zhì)粒pCRISPomyces-2 酶切位點(diǎn)XbaI 如需更詳細(xì)線索 我會(huì)在后面補(bǔ)充 或者有做過相關(guān)試驗(yàn)的小伙伴嗎，求指點(diǎn)！ 多謝！ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2020-01-18 20:29:13
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2020-01-18 20:29:13
| in-fusion也失�。吭O(shè)置過陽性對照么？載體自連？試試pcr線性化載體 |
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2樓2020-01-02 13:15:50
3樓2020-01-02 13:29:17
★ ★ ★
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2020-01-18 20:29:22
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2020-01-18 20:29:22
| 實(shí)在不行試試雙酶切吧，我們實(shí)驗(yàn)室基本都是雙酶切。酶切連接失敗我首先會(huì)檢查擴(kuò)增片段的引物上是否有相應(yīng)的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基；其次是質(zhì)粒上確實(shí)具有這兩個(gè)酶切位點(diǎn)序列（一定要在質(zhì)粒上搜到相應(yīng)的序列，有些質(zhì)粒圖譜畫的不靠譜）。最后考慮試劑是否過期。祝你好運(yùn) |
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4樓2020-01-02 19:49:06
8樓2020-01-03 15:29:46
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2020-01-18 20:29:36
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2020-01-18 20:29:36
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樓主可以考慮換一種大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，我構(gòu)建過一種載體質(zhì)粒，只有xl_blue好用，其他DH5a，jm109都不好使，樓主可以試試看，可能有用 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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9樓2020-01-04 19:22:33
tenghaiyan
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有些片段做菌液PCR未必能擴(kuò)到，我曾經(jīng)被困擾半年才發(fā)現(xiàn) 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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10樓2020-01-05 07:54:04
coostudent
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5樓2020-01-03 14:45:04
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6樓2020-01-03 14:45:44
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7樓2020-01-03 14:48:36
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