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云是天空白新蟲 (初入文壇)
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[求助]
重組酵母表達(dá)問題 已有1人參與
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 各位大佬，小弟目前正在用畢赤酵母做組成型的表達(dá)菌株，出發(fā)菌株用的GS115（SMD1168、X33等也試過），質(zhì)粒載體用的pPIC9K，方法是用GAP啟動(dòng)子基因序列將9K上的AOX1啟動(dòng)子序列替換掉（從SacⅠ酶切位點(diǎn)開始到BamHⅠ結(jié)束全部替換），延用a-MF信號(hào)肽，后面緊跟著我的目的蛋白，構(gòu)建后選用SalⅠ或BglⅡ酶進(jìn)行線性化電轉(zhuǎn)至GS115酵母中，開始做時(shí)SDS電泳，以及WB檢測(cè)都成功了，液相也跑了，各種檢測(cè)結(jié)果都是正確的�，F(xiàn)在出現(xiàn)了一個(gè)問題，構(gòu)建后的相同一管的質(zhì)粒無(wú)論用什么酶線性化，或者轉(zhuǎn)至哪一種酵母，經(jīng)過抗性篩選再轉(zhuǎn)至G418平板后挑取的單克隆都無(wú)法表達(dá)目的蛋白了。目前最近的一次實(shí)驗(yàn)嘗試了直接挑取MD平板上的，和轉(zhuǎn)涂至G418上的菌株，發(fā)現(xiàn)MD上的能夠表達(dá)，而G418上的單克隆無(wú)法表達(dá)。望各位前輩大佬不吝賜教！拜謝各位了 |
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4樓2020-12-18 15:03:39
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【答案】應(yīng)助回帖
| 您好，我想來詢問一下畢赤酵母再M(fèi)D平板上篩選的問題。我用的是ppic9k和gs115菌株，也差不多做了5次電轉(zhuǎn)了，但是涂在MD平板上就是不長(zhǎng)斑，轉(zhuǎn)的ppic9k空載也不長(zhǎng)，不知道是哪里出了問題，所以想來問一下你這個(gè)問題最后解決了嗎？有什么別的方法？我是gs115到od＝1.0左右就制備感受態(tài)了，用的pme I線性化載體，用乙醇沉淀法回收DNA，然后轉(zhuǎn)了大概5ug的載體進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)條件是1500V，25μF，200Ω，2mm電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)過后顯示4.9ms和1491V，感覺都挺完美的但是就是在MD平板上長(zhǎng)不起來。我試過三種方法，一個(gè)是電轉(zhuǎn)后加山梨醇后馬上涂板，第二種是加完山梨醇30度靜置1h后涂板，第三個(gè)是靜置1h后放去30℃搖床復(fù)蘇1h后再涂板，這三種方法都沒能在MD平板上長(zhǎng)起來，所以我想來請(qǐng)教一下，感謝！ |
5樓2024-11-03 18:02:15
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