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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » DNA重組 » 重組酵母表達問題
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重組酵母表達問題 已有1人參與
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 各位大佬，小弟目前正在用畢赤酵母做組成型的表達菌株，出發(fā)菌株用的GS115（SMD1168、X33等也試過），質粒載體用的pPIC9K，方法是用GAP啟動子基因序列將9K上的AOX1啟動子序列替換掉（從SacⅠ酶切位點開始到BamHⅠ結束全部替換），延用a-MF信號肽，后面緊跟著我的目的蛋白，構建后選用SalⅠ或BglⅡ酶進行線性化電轉至GS115酵母中，開始做時SDS電泳，以及WB檢測都成功了，液相也跑了，各種檢測結果都是正確的。現在出現了一個問題，構建后的相同一管的質粒無論用什么酶線性化，或者轉至哪一種酵母，經過抗性篩選再轉至G418平板后挑取的單克隆都無法表達目的蛋白了。目前最近的一次實驗嘗試了直接挑取MD平板上的，和轉涂至G418上的菌株，發(fā)現MD上的能夠表達，而G418上的單克隆無法表達。望各位前輩大佬不吝賜教！拜謝各位了 |
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2樓2019-11-28 13:33:48
3樓2019-11-30 01:32:49
15845856241
新蟲 (小有名氣)
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4樓2020-12-18 15:03:39
Epiphany_I
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【答案】應助回帖
| 您好，我想來詢問一下畢赤酵母再MD平板上篩選的問題。我用的是ppic9k和gs115菌株，也差不多做了5次電轉了，但是涂在MD平板上就是不長斑，轉的ppic9k空載也不長，不知道是哪里出了問題，所以想來問一下你這個問題最后解決了嗎？有什么別的方法？我是gs115到od＝1.0左右就制備感受態(tài)了，用的pme I線性化載體，用乙醇沉淀法回收DNA，然后轉了大概5ug的載體進感受態(tài)細胞，電轉條件是1500V，25μF，200Ω，2mm電轉，電轉過后顯示4.9ms和1491V，感覺都挺完美的但是就是在MD平板上長不起來。我試過三種方法，一個是電轉后加山梨醇后馬上涂板，第二種是加完山梨醇30度靜置1h后涂板，第三個是靜置1h后放去30℃搖床復蘇1h后再涂板，這三種方法都沒能在MD平板上長起來，所以我想來請教一下，感謝！ |
5樓2024-11-03 18:02:15
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