 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1972 | 回復(fù): 4 | ||
云是天空白新蟲 (初入文壇)
|
[求助]
重組酵母表達問題 已有1人參與
|
 各位大佬，小弟目前正在用畢赤酵母做組成型的表達菌株，出發(fā)菌株用的GS115（SMD1168、X33等也試過），質(zhì)粒載體用的pPIC9K，方法是用GAP啟動子基因序列將9K上的AOX1啟動子序列替換掉（從SacⅠ酶切位點開始到BamHⅠ結(jié)束全部替換），延用a-MF信號肽，后面緊跟著我的目的蛋白，構(gòu)建后選用SalⅠ或BglⅡ酶進行線性化電轉(zhuǎn)至GS115酵母中，開始做時SDS電泳，以及WB檢測都成功了，液相也跑了，各種檢測結(jié)果都是正確的�，F(xiàn)在出現(xiàn)了一個問題，構(gòu)建后的相同一管的質(zhì)粒無論用什么酶線性化，或者轉(zhuǎn)至哪一種酵母，經(jīng)過抗性篩選再轉(zhuǎn)至G418平板后挑取的單克隆都無法表達目的蛋白了。目前最近的一次實驗嘗試了直接挑取MD平板上的，和轉(zhuǎn)涂至G418上的菌株，發(fā)現(xiàn)MD上的能夠表達，而G418上的單克隆無法表達。望各位前輩大佬不吝賜教！拜謝各位了 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
推薦一些20種氨基酸檢測的實際應(yīng)用案例
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有124人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
2樓2019-11-28 13:33:48
Acov
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 170.8
- 帖子: 74
- 在線: 44.9小時
- 蟲號: 18805650
- 注冊: 2019-10-24
- 專業(yè): 腫瘤學(xué)
3樓2019-11-30 01:32:49
15845856241
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 169.9
- 散金: 5
- 帖子: 61
- 在線: 21.1小時
- 蟲號: 21178954
- 注冊: 2020-02-23
- 專業(yè): 生物化學(xué)
4樓2020-12-18 15:03:39
Epiphany_I
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 28
- 帖子: 10
- 在線: 3.8小時
- 蟲號: 32871587
- 注冊: 2023-02-23
- 專業(yè): 獸醫(yī)傳染病學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
| 您好，我想來詢問一下畢赤酵母再MD平板上篩選的問題。我用的是ppic9k和gs115菌株，也差不多做了5次電轉(zhuǎn)了，但是涂在MD平板上就是不長斑，轉(zhuǎn)的ppic9k空載也不長，不知道是哪里出了問題，所以想來問一下你這個問題最后解決了嗎？有什么別的方法？我是gs115到od＝1.0左右就制備感受態(tài)了，用的pme I線性化載體，用乙醇沉淀法回收DNA，然后轉(zhuǎn)了大概5ug的載體進感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)條件是1500V，25μF，200Ω，2mm電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)過后顯示4.9ms和1491V，感覺都挺完美的但是就是在MD平板上長不起來。我試過三種方法，一個是電轉(zhuǎn)后加山梨醇后馬上涂板，第二種是加完山梨醇30度靜置1h后涂板，第三個是靜置1h后放去30℃搖床復(fù)蘇1h后再涂板，這三種方法都沒能在MD平板上長起來，所以我想來請教一下，感謝！ |
5樓2024-11-03 18:02:15
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 云是天空白 的主題更新
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考博] 26申博 求博導(dǎo) +3 | 愛讀書的小帥 2026-02-28 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 中國林科院林化所（南京）2026年招收化學(xué)/材料/環(huán)境工程等背景碩士研究生3名 +3 | realstar2006 2026-02-27 | 3/150 |
|
|
[考研] 306求調(diào)劑 +7 | 張張張張oo 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 理學(xué)，工學(xué)，農(nóng)學(xué)調(diào)劑，少走彎路，這里歡迎您！ +8 | likeihood 2026-03-02 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 280分 +10 | yyqqhh 2026-03-03 | 10/500 |
|
|
|
[碩博家園] 2025屆雙非化工碩士畢業(yè)，申博 +4 | 更多的是 2026-02-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +9 | 鹿沫笙 2026-03-02 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)085600 319分 材料與化工 金屬方向 求調(diào)劑 +4 | 青科11 2026-03-02 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 化工270求調(diào)劑 +10 | 什么名字qwq 2026-03-02 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +5 | kkcoco25 2026-03-02 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 26考研報考西工大材料308分求調(diào)劑 +4 | weizhong123 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +3 | MuoLuo1312 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0857調(diào)劑 +6 | 一ll半 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑院校 +6 | 云朵452 2026-03-02 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 0856化工專碩求調(diào)劑 +15 | 董boxing 2026-03-01 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +5 | 2026計算機_誠心 2026-03-01 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +3 | L-xin? 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)調(diào)劑 +10 | 提神豆沙包 2026-02-28 | 12/600 |
|
|
|
[碩博家園] 博士自薦 +7 | 科研狗111 2026-02-26 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑 +3 | 簡木ChuFront 2026-02-28 | 3/150 |
|