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之前實(shí)驗(yàn)室一直用inversespcr定位外緣插入片段，我們是做植物，最近一個(gè)月，一直做不出來，跑膠全是空白，酶以及其他試劑幾乎換了個(gè)遍，就是不行，大家有沒有遇到類似情況，求助！ @wizardfan @biostar2009 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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首先 這類實(shí)驗(yàn)?zāi)阋欢ㄒ_定不是技術(shù)問題， 最好的方法是 你找個(gè)做過inverse pcr的人帶你做 我以前也是做一個(gè)月做不出來 后來發(fā)現(xiàn)是酶壞了（被師弟放在室溫下太久了，變質(zhì)了）。 后來發(fā)現(xiàn)pcr cycles溫度不太對(duì)（92-55-72）。 后來發(fā)現(xiàn)跑膠的染料變質(zhì)，染不上去。 最后找個(gè)分子生物學(xué)專家?guī)兔Σ彭樌鉀Q。 你一定要找個(gè)曾經(jīng)成功過的人帶你，而且要先確認(rèn)你的所有材料都是好的，技術(shù)環(huán)節(jié)不出錯(cuò) 其次 即使技術(shù)環(huán)節(jié)不出錯(cuò)， inverse pcr這個(gè)技術(shù)本身， 也未必可以成功。 這個(gè)純粹看運(yùn)氣， 你定位插入的地方， 如果距離切割（限制性內(nèi)切酶）的地方太遠(yuǎn)， 比如2w個(gè)base pairs（有點(diǎn)夸張的比喻）， 那你肯定pcr不成。 這種情況要做full genome sequence，燒錢是唯一的辦法。 |
4樓2020-07-30 09:24:53
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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首先 這類實(shí)驗(yàn)?zāi)阋欢ㄒ_定不是技術(shù)問題， 最好的方法是 你找個(gè)做過inverse pcr的人帶你做 我以前也是做一個(gè)月做不出來 后來發(fā)現(xiàn)是酶壞了（被師弟放在室溫下太久了，變質(zhì)了）。 后來發(fā)現(xiàn)pcr cycles溫度不太對(duì)（92-55-72）。 后來發(fā)現(xiàn)跑膠的染料變質(zhì)，染不上去。 最后找個(gè)分子生物學(xué)專家?guī)兔Σ彭樌鉀Q。 你一定要找個(gè)曾經(jīng)成功過的人帶你，而且要先確認(rèn)你的所有材料都是好的，技術(shù)環(huán)節(jié)不出錯(cuò) 其次 即使技術(shù)環(huán)節(jié)不出錯(cuò)， inverse pcr這個(gè)技術(shù)本身， 也未必可以成功。 這個(gè)純粹看運(yùn)氣， 你定位插入的地方， 如果距離切割（限制性內(nèi)切酶）的地方太遠(yuǎn)， 比如2w個(gè)base pairs（有點(diǎn)夸張的比喻）， 那你肯定pcr不成。 這種情況要做full genome sequence，燒錢是唯一的辦法。 |
2樓2020-07-30 09:21:39
3樓2020-07-30 09:24:22
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謝謝回答，不是很會(huì)用小木蟲，抱歉才看到，整個(gè)體系之前實(shí)驗(yàn)室做了一年，非常成熟，師兄帶我做的，后來師兄畢業(yè)了，我們是做很多獨(dú)立樣品，而且是四堿基酶，所以做一次二十多個(gè)樣品，如果成功的話不會(huì)一個(gè)也做不出來，各種試劑沒有問題，酶和引物都用新的，循環(huán)我也用的55度，我還會(huì)進(jìn)行二次循環(huán)，用58度，最近一直在做，還是不行，有點(diǎn)氣餒了 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
5樓2020-12-24 22:26:39
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