 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 8 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 5458 | 回復(fù): 7 | ||
豬妹妹May鐵蟲 (初入文壇)
|
[求助]
【求助】ChIP超聲效果檢驗(yàn)的解交聯(lián)問題/DNA彌散片段集中于5000bp
|
|
大家好，剛接觸ChIP，遇到了比較疑惑的（猜測可能是）解交聯(lián)的問題，希望大家能給予指導(dǎo)，先說聲謝謝！ 年前預(yù)實(shí)驗(yàn)交聯(lián)（1%甲醛，5-10min）、超聲（bioruptor plus-high-30s on/off-薄壁管）、解交聯(lián)消化（65度0.25M Nacl振搖過夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）、純化DNA，有得到我們認(rèn)為比較好的電泳結(jié)果，如圖1所示。 【問題來了！  】正打算進(jìn)一步確定最佳的交聯(lián)時(shí)間和超聲數(shù)的時(shí)候，出現(xiàn)了圖2的電泳結(jié)果（DNA不彌散了集中在5000bp，感覺是基因組DNA的位置）。于是陸續(xù)更換了甲醛、Nacl、蛋白酶K、RNAse，還參考論壇上的解交聯(lián)條件變化了一下解交聯(lián)和消化的順序……換了新買的蛋白酶K之后，膠圖終于有了一點(diǎn)變化，但主條帶還是沒有下來：請(qǐng)看圖2。 舊樣品里的H-25是第一張圖的#7(之前解交聯(lián)電泳結(jié)果不錯(cuò)的，取了-80凍的超聲樣品重新解交聯(lián)），考慮到①H-25這個(gè)結(jié)果； ②25/30 cycle已經(jīng)是一個(gè)比較長的超聲時(shí)間了，12.5/15min，和文獻(xiàn)中的也差不多； ③超聲循環(huán)數(shù)的增加并沒有使DNA條帶發(fā)生一點(diǎn)點(diǎn)下移； ④lab另一位同學(xué)也做chip，他ip的不是TF所以直接用了SDS lysis buffer（1%SDS，我的sonication buffer里的SDS是0.1%）和國產(chǎn)的超聲儀器（不記得型號(hào)了），其他試劑（甲醛、甘氨酸、Nacl、RNAse、蛋白酶K）都用的我的，順利得到了理想的片段化基因。 所以我們更偏向認(rèn)為是超聲之后的步驟發(fā)生問題，但試劑基本換過了，實(shí)在排除不出原因。只好來論壇求助，有沒有做過chip的大神能看出哪里出問題呢…… 補(bǔ)充： 1.buffer配方：因?yàn)橄胍狪P的是轉(zhuǎn)錄因子，所以當(dāng)時(shí)和師兄參考了文獻(xiàn)之后，決定自己配制比較溫和的buffer（一直放在4度，使用前現(xiàn)加cocktail），配方如下： lysis buffer I (50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, protease inhibitors) lysis buffer II (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mMEDTA, 0.5 mM EGTA, protease inhibitors) sonication buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS, and 1% Triton X-100, protease inhibitors) 2.目前的解交聯(lián)條件是：37 ℃ RNAse 1h，65 ℃ 0.2mM Nacl+蛋白酶K 靜置過夜，酚氯仿異戊醇純化DNA。上圖最右測是分別不加蛋白酶K、不解交聯(lián)、不加RNAse想看有啥影響，發(fā)現(xiàn)好像沒啥影響，更疑惑了……更迷的是，不加蛋白酶K的效果反而更好。�？偛粫�(huì)是蛋白酶K把DNA鎖在那了吧，可DNA純化應(yīng)該也去掉了啊。。 3.之所以更改解交聯(lián)的流程，一方面參考了其他人的步驟，另一方面是因?yàn)樽约涸镜膒rotocol（65度0.25M Nacl振搖過夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）65度過夜之后會(huì)出現(xiàn)小白片、片狀沉淀，加了蛋白酶K之后消失。自己年前預(yù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候沒有注意是否有這個(gè)現(xiàn)象，問了其他人沒有這個(gè)高溫析出蛋白的情況；不知道是否預(yù)示著哪里出了問題？ 4.比對(duì)了buffer的成分，其實(shí)和常用的也挺像，感覺就是濃度低一些，按理說放四度不會(huì)有啥變化啊，可也沒有別的東西能懷疑了。有沒有朋友可以支支招？ 大家有任何建議或提示都請(qǐng)?jiān)u論，我先謝為敬�。�！ |
回復(fù)此樓» 本帖附件資源列表
-
歡迎監(jiān)督和反饋：小木蟲僅提供交流平臺(tái)，不對(duì)該內(nèi)容負(fù)責(zé)。
本內(nèi)容由用戶自主發(fā)布，如果其內(nèi)容涉及到知識(shí)產(chǎn)權(quán)問題，其責(zé)任在于用戶本人，如對(duì)版權(quán)有異議，請(qǐng)聯(lián)系郵箱：xiaomuchong@tal.com - 附件 1 : 1.png
- 附件 2 : 2.png
- 附件 3 : 3.png
2020-05-30 02:46:58, 232.99 K
2020-05-30 02:46:59, 190.79 K
2020-05-30 02:46:59, 265.6 K
» 猜你喜歡
推薦一些20種氨基酸檢測的實(shí)際應(yīng)用案例
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有178人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
0o向日葵o0
新蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1999.1
- 散金: 50
- 紅花: 2
- 沙發(fā): 2
- 帖子: 913
- 在線: 156.9小時(shí)
- 蟲號(hào): 2369477
- 注冊(cè): 2013-03-22
- 專業(yè): 植物病理學(xué)
2樓2020-05-30 09:32:51
豬妹妹May
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 44.3
- 帖子: 30
- 在線: 8.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 4726009
- 注冊(cè): 2016-05-26
- 專業(yè): 細(xì)胞增殖、生長與分化
|
您好，這個(gè)超聲和交聯(lián)條件之前已經(jīng)打下來片段的，在圖1。用之前超聲效果OK的超聲樣品重新拿去解交聯(lián)、純化也解不出來了。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2020-05-30 11:38:58
mooun
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 107.4
- 帖子: 37
- 在線: 6.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 14492040
- 注冊(cè): 2019-03-05
- 專業(yè): 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)
|
猜測，轉(zhuǎn)錄因子是屬于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，同一批樣品一個(gè)先做一個(gè)后做，交聯(lián)和破碎的時(shí)間可能就需要重新摸索下，我們前面做就出現(xiàn)過這樣情況，先摸索出的條件在做同一批低溫保存了的樣品就不行 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2020-06-01 17:06:37
豬妹妹May
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 44.3
- 帖子: 30
- 在線: 8.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 4726009
- 注冊(cè): 2016-05-26
- 專業(yè): 細(xì)胞增殖、生長與分化
5樓2020-06-02 00:57:04
豬妹妹May
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 44.3
- 帖子: 30
- 在線: 8.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 4726009
- 注冊(cè): 2016-05-26
- 專業(yè): 細(xì)胞增殖、生長與分化
|
大家好，之前老師建議我先往后做IP，做了一次感覺data沒有用，做一次挺費(fèi)抗體的，還是回來摸條件了。 前面敘述中有提到我的裂解液是自己配的，兩步裂解之后還要更換自配的超聲buffer（0.1%SDS，一共三個(gè)buffer）。然后，同學(xué)用的裂解液就是最常用的SDS lysis buffer【1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.1)】。我分別用了自己的三步裂解液和同學(xué)的裂解液、Bioruptor plus和實(shí)驗(yàn)室的國產(chǎn)超聲儀。結(jié)果如下： 鏈接: https://pan.baidu.com/s/1dAoSHIz5pjDoxodLbRas-w 提取碼: cevv 復(fù)制這段內(nèi)容后打開百度網(wǎng)盤手機(jī)App，操作更方便哦 換了buffer之后就打下來了，而且片段化基因完全符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，說明自己的三步buffer的確出了問題。 但還有兩個(gè)疑點(diǎn)： ①如何解釋之前解交聯(lián)成功的超聲樣品，無法再次解交聯(lián)？是否凍存的已超聲樣品中的超聲buffer某些成分也同步變質(zhì)使其交聯(lián)無法逆轉(zhuǎn)？ ②這次超聲cycle對(duì)應(yīng)的是30cycle，之前用自己的buffer在20、25就可以得到更小的片段，難道一開始并沒有真的打斷DNA？不過也有可能是因?yàn)榧?xì)胞密度不同。 所以，我下一步打算用新配的超聲buffer試一下，如果可以，就立即盡快把解交聯(lián)實(shí)驗(yàn)做完，避免樣品受超聲buffer影響。如果新配的超聲buffer不行，跟導(dǎo)師商量一下是不是用1%SDS lysis buffer試試。之前是擔(dān)心1%SDS會(huì)使轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)變性，影響結(jié)合；本來結(jié)合就比較弱，擔(dān)心檢測不到信號(hào)。有沒有做過轉(zhuǎn)錄因子ChIP的大佬可以在lysis buffer上給點(diǎn)建議呢？ |
6樓2020-06-02 01:22:27
豬妹妹May
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 44.3
- 帖子: 30
- 在線: 8.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 4726009
- 注冊(cè): 2016-05-26
- 專業(yè): 細(xì)胞增殖、生長與分化
|
更新一下，最早之所以用了自己配的配方復(fù)雜的裂解液是因?yàn)镃hIP做的是Tfs，怕kit自帶的1% SDS buffer太強(qiáng)。 后來，一樓說的問題解決了，應(yīng)該是自己配的裂解液失效了，具體原因不明，反正重新配了，超聲的膠圖就不會(huì)出現(xiàn)基因組條帶了。 具體的protocol后來也是用的最簡單的，和碧云天kit差不多的配方。具體的分享一下： 甲醛交聯(lián)：0.8% formaldehyde 7min 裂解液：0.2% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.1) 存于室溫 超聲條件：Bioruptor (Diagenode) with 30 s on and 30 s off at 4℃ on a high power output for 17~18 cycles 5 M NaCl解交聯(lián)： 65°C旋轉(zhuǎn)孵育>4hr/過夜 2 μl Proteinase K（20mg/ml，碧云天）65°C孵育1 h（正式ChIP樣品是500ul體系：加10ul 0.5M EDTA，20ul 1M tris-HCl（pH6.5），2ul蛋白酶K） 至于之前說的小白片的問題，我是先解交聯(lián)再加蛋白酶K，而師姐是兩步一起做的所以沒看到小白片。個(gè)人猜測是解交聯(lián)之后析出的蛋白，加完蛋白酶K消化完自然就消失了。 再者就是，除了ChIP-qPCR檢測，用qUBIT也能明顯看出有沒有拉下來DNA，nanodrop測DNA濃度的精度不夠。 |
7樓2022-03-23 09:57:59
atikou
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 74.9
- 帖子: 96
- 在線: 18.9小時(shí)
- 蟲號(hào): 22783210
- 注冊(cè): 2020-06-10
- 專業(yè): 基因表達(dá)調(diào)控與表觀遺傳學(xué)
8樓2022-03-27 14:44:58
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 豬妹妹May 的主題更新
| 8 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 能動(dòng)297求調(diào)劑，本科川大 +3 | 邵11 2026-03-04 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 085600 材料與化工 298 +11 | 小西笑嘻嘻 2026-03-03 | 11/550 |
|
|
|
[考博] 26申博 +5 | north， 2026-02-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085601 材料305分求助 +3 | 泡泡郵件 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 347求調(diào)劑 +3 | 啊歐歐歐 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304分材料專碩求調(diào)劑 +5 | qiuzhigril 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 歡迎采礦、地質(zhì)、巖土、計(jì)算機(jī)、人工智能等專業(yè)的同學(xué)報(bào)考 +8 | pin8023 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境工程學(xué)碩288求助調(diào)劑 +7 | 多吃億口芝士 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)306調(diào)劑 +4 | 26要上岸 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 298 調(diào)劑 +3 | 小西笑嘻嘻 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿中科大能動(dòng)297求調(diào)劑，本科川大 +3 | 邵11 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 278求調(diào)劑 +3 | 滿天星11_22 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +3 | MuoLuo1312 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0857調(diào)劑 +6 | 一ll半 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 295求調(diào)劑。一志愿報(bào)考鄭州大學(xué)化學(xué)工藝學(xué)碩，總分295分 +8 | yl1 2026-03-02 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0856求調(diào)劑285 +11 | 呂仔龍 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 材料復(fù)試調(diào)劑 +5 | 學(xué)材料的點(diǎn) 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 261求調(diào)劑 +3 | 陸lh 2026-03-01 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 322求調(diào)劑 +3 | 熊境喆 2026-03-01 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +6 | 曼殊2266 2026-02-28 | 7/350 |
|