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秦風(fēng)拂面新蟲 (初入文壇)
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[求助]
請(qǐng)問如何科學(xué)計(jì)算酶突變體前后酶活的變化值 已有1人參與
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大家好，向大家請(qǐng)教一個(gè)問題: 鄙人最近在做酶的定向改造，需要對(duì)氨基酸序列中某些氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，以提高其催化活性，酶是通過胞外異源表達(dá)得到的。 但是考慮到通過發(fā)酵產(chǎn)酶，發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量受到發(fā)酵時(shí)間、接種量以及菌種狀態(tài)等因素的影響，無法保證野生型菌株和突變體菌株發(fā)酵液中單位體積所含重組蛋白質(zhì)量的一致性，所以無法直接通過測定發(fā)酵液中的酶活，來比較突變體菌株所產(chǎn)酶活的變化，也就是不知道怎么保持突變前后測定條件的一致性。 所以想向大家請(qǐng)教一下，應(yīng)該怎么科學(xué)地比較突變體酶活相對(duì)野生型菌株的變化值，這個(gè)問題最近困擾我很久了，求好心的大佬賜教。 @wizardfan @biostar2009 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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如果能把蛋白純化出來，用同樣的量進(jìn)行對(duì)比野生型與突變性，這樣比較能證明是蛋白的表觀活性變化（還有可能是其他原因）。 否則可能是突變蛋白表達(dá)量提升了，或者突變蛋白穩(wěn)定性不好，或者其他原因，導(dǎo)致突變體或野生型在粗酶液中活性差異。 折中的做法是仍然用粗酶液，電泳做western，用western定量來校準(zhǔn)粗酶液中的目的蛋白，工作量其實(shí)也不小。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
秦風(fēng)拂面
2樓2024-04-14 09:50:22
秦風(fēng)拂面
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
3樓2024-05-07 21:15:47
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