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細(xì)胞侵襲，血管生成，"膠" 你做實(shí)驗(yàn)！ | MedChemExpress
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1971 年，judah folkman 教授提出 “腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于血管新生” 理論，認(rèn)為新血管的形成對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。血管生成和細(xì)胞侵襲怎樣設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)？想要具體實(shí)驗(yàn) protocol？ 一文帶你走進(jìn)熱門實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為發(fā)表高分文獻(xiàn)提供新思路，“膠”你做實(shí)驗(yàn)！ 基底膜是一層特化薄而柔韌的胞外基質(zhì) (無細(xì)胞薄膜狀結(jié)構(gòu))，位于上皮細(xì)胞基底面與深部結(jié)締組織間。基底膜在發(fā)育和傷口愈合時(shí)會(huì)發(fā)生退化及再生，它不僅為細(xì)胞和細(xì)胞層提供支持，也為血管生成提供其所必需的環(huán)境，還是轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞侵襲的主要屏障。此外，基底膜還可通過影響細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化對(duì)組織形成產(chǎn)生重要作用[1]。 圖 1. 間質(zhì)基質(zhì)和基底膜的組成[1]。 基底膜基質(zhì)膠 (basement membrane matrix) 是從富含胞外基質(zhì)蛋白的小鼠腫瘤中提取出的天然基底膜基質(zhì)，主要成分是各類生長(zhǎng)因子及細(xì)胞外基質(zhì)成分。 tips! 基質(zhì)膠主要細(xì)胞外基質(zhì)成分有：層粘連蛋白 (laminin)、iv 型膠原蛋白 (col-iv)、巢蛋白 (entactin)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖 (heparan sulphate proteoglycans) 等。 基質(zhì)膠也包含多種生長(zhǎng)因子，例如：類胰島素生長(zhǎng)因子 (igf-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β (tgf-β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vegf)、表皮生長(zhǎng)因子 (egf)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bfgf) 等。 基于基底膜基質(zhì)膠的組成及特性，基底膜基質(zhì)膠對(duì)于體外模擬細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境提供了非常重要的支持，其應(yīng)用包括免疫缺陷型小鼠體內(nèi)腫瘤形成、類器官培養(yǎng)、腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、體外和體內(nèi)血管生成研究、干細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和分化等。 腫瘤組織具有高度血管化的特征，腫瘤的生長(zhǎng)依賴于新生血管。由于血管生成 (angiogenesis) 對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和侵入轉(zhuǎn)移、特別對(duì)腫瘤早期發(fā)生的重要影響，已成為近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。 由于內(nèi)皮細(xì)胞在基底膜提取物上培養(yǎng)時(shí)可形成三維毛細(xì)血管樣管狀結(jié)構(gòu)，血管生成實(shí)驗(yàn)成為一種簡(jiǎn)單、定量、可靠且功能強(qiáng)大的模型，常用于研究抑制劑和激活劑對(duì)血管生成的影響。 ▐【實(shí)驗(yàn)步驟】 1. 準(zhǔn)備基質(zhì)膠 實(shí)驗(yàn)前一天將 -20℃ 保存的基質(zhì)膠埋于碎冰放入 4 ℃ 冰箱，使基質(zhì)膠過夜緩慢融化。實(shí)驗(yàn)開始前，將基質(zhì)膠放在冰盒中，將 96 孔板和 1 ml 槍頭放置在冰上預(yù)冷，基質(zhì)膠用預(yù)冷槍頭混勻。 2. 鋪基質(zhì)膠 準(zhǔn)備預(yù)冷的 1.5 ml 離心管用于稀釋基質(zhì)膠，以基質(zhì)膠: dmem 培養(yǎng)基為 1:1 或 2:1 的稀釋比稀釋。稀釋后向 96 孔板每孔加入 50-80 μl 稀釋后的基質(zhì)膠，垂直加入避免產(chǎn)生氣泡。在 37℃ 培養(yǎng)箱中放置 45 分鐘~1 小時(shí)使基質(zhì)膠凝固。 3. 鋪細(xì)胞 使用 3-5 代狀態(tài)較好的 huvec 細(xì)胞，消化細(xì)胞，用含 10% 血清的 dmem 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。96 孔板每孔加入 50-100 μl，3-5 萬個(gè)細(xì)胞的重懸液，每組重復(fù)三孔。將 96 孔板置于 37℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4-12 小時(shí)后可見血管形成。 4. 定量分析 使用 imagej 中 angiogenesis analyzer 插件對(duì)血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)。 ▐【結(jié)果示例圖】 圖 2. huvec 細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn)[2][3]。 ▐【注意事項(xiàng)】 1. 為什么基質(zhì)膠液面不平有氣泡？ 鋪膠時(shí)手持移液槍垂直于 96 孔板內(nèi)孔的正上方垂直加入，防止基質(zhì)膠沾到孔壁上。當(dāng)剛加膠時(shí)出現(xiàn)明顯的氣泡，可使用吸頭輕觸戳破，后續(xù)搖平即可。若孔底部沒有鋪勻，可晃動(dòng)孔板使其均勻鋪于底部。 2. 成管時(shí)間怎么判斷？ 成管時(shí)間與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)。細(xì)胞狀態(tài)好時(shí)，2-3 小時(shí)開始成管，細(xì)胞狀態(tài)較差時(shí)，可能 18-24 h 成管；如果使用原代內(nèi)皮細(xì)胞而非永生化細(xì)胞，開始成管的時(shí)間會(huì)延遲幾個(gè)小時(shí)；建議首次實(shí)驗(yàn)每 4 個(gè)小時(shí)觀察一次。 細(xì)胞侵襲 (cell invasion) 是指細(xì)胞通過細(xì)胞外基質(zhì)從一個(gè)區(qū)域遷移到另一個(gè)區(qū)域的能力，是正常細(xì)胞或癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)和機(jī)械刺激做出的正常反應(yīng)，通常發(fā)生在胚胎發(fā)育、血管生成、傷口修復(fù)、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和癌癥轉(zhuǎn)移等過程中。 圖 3. transwell 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)示意圖[4]。 在腫瘤相關(guān)研究中，利用 transwell 小室檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力十分常見。在 transwell 小室的聚碳酸酯膜上側(cè)鋪一層基質(zhì)膠模擬細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶消化基質(zhì)進(jìn)入下室，最后計(jì)算下室的細(xì)胞量即可反映細(xì)胞的侵襲能力。 ▐【實(shí)驗(yàn)步驟】 1. 準(zhǔn)備基質(zhì)膠 實(shí)驗(yàn)前一天將 -20℃ 保存的基質(zhì)膠埋于碎冰放入 4℃ 冰箱，使基質(zhì)膠過夜緩慢融化。實(shí)驗(yàn)開始前，將基質(zhì)膠放在冰盒中，將 24 孔板和 1 ml 槍頭放置在冰上預(yù)冷，基質(zhì)膠用預(yù)冷槍頭混勻。 2. 鋪基質(zhì)膠 準(zhǔn)備預(yù)冷的 1.5 ml 離心管用于稀釋基質(zhì)膠，以基質(zhì)膠: dmem 培養(yǎng)基為 1:8 的稀釋比稀釋 (根據(jù)細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶的含量，稀釋比例需要摸索)。取 60-100 μl基質(zhì)膠添加到 transwell 小室上層 (注意不要出現(xiàn)氣泡)，于 37℃ 培養(yǎng)箱中孵育 3 h，使基質(zhì)膠聚合成薄膜。孵育后將上室中多余液體吸掉，每孔加入 100 μl 無血清培養(yǎng)基后，于 37℃ 培養(yǎng)箱放置 30 min，進(jìn)行基底膜水化。 3. 鋪細(xì)胞 在 24 孔板下室加入 600 μl 含有 10% 胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。消化細(xì)胞，用 pbs 清洗細(xì)胞，使用含有 bsa 的無血清培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度至 1-10×105個(gè)/ml (不同細(xì)胞大小和侵襲能力不同，可設(shè)置濃度梯度以達(dá)到最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。用鑷子將 transwell 小室置于 24 孔板內(nèi) (注意不要產(chǎn)生氣泡)，取 100-200 μl 細(xì)胞懸液，加入 transwell 小室上層。將 24 孔板置于 37℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24-72 h (依照細(xì)胞侵襲能力而定)。 4. 結(jié)晶紫染色 棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，24 孔板加入 500 μl 4% 多聚甲醛固定液固定 30 分鐘，pbs 清洗。加入 500 μl 結(jié)晶紫溶液，染色 30 分鐘，使用 pbs 清洗去除浮液。適當(dāng)風(fēng)干后即可進(jìn)行顯微鏡觀察、拍照和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 ▐【結(jié)果示例圖】 圖 4. mda-231 細(xì)胞和 mda-231-hm 細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)[5]。 ▐【注意事項(xiàng)】 1. 結(jié)晶紫染色后細(xì)胞分布不均一？ 可能原因：transwell 小室傾斜放置在孔板中；細(xì)胞消化不完全；細(xì)胞懸液添加不均勻；基質(zhì)膠膠面不均勻。 2. transwell 小室下層細(xì)胞過少？ 可能原因：細(xì)胞的侵襲能力弱；基質(zhì)膠濃度偏高厚度偏厚；細(xì)胞接種數(shù)量少；transwell 小室孔徑偏小；transwell 小室放入孔板時(shí)有氣泡等。 歡迎留言投稿！ 本期為大家介紹了血管生成和細(xì)胞侵襲的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和注意事項(xiàng)，各位小伙伴們！或許你有其他想要了解的實(shí)驗(yàn) protocol？ 小 m 歡迎大家留言評(píng)論，安排您的 “專屬” 實(shí)驗(yàn)操作指南或相關(guān)主題講座喔~ mce 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。 參考文獻(xiàn)： [1] bonnans c, et al. remodelling the extracellular matrix in development and disease. nat rev mol cell biol. 2014 dec;15(12):786-801. [2] dai x, et al. aspirin inhibits cancer metastasis and angiogenesis via targeting heparanase. clin cancer res. 2017 oct 15;23(20):6267-6278. [3] carpentier g,et al. angiogenesis analyzer for imagej - a comparative morphometric analysis of "endothelial tube formation assay" and "fibrin bead assay". sci rep. 2020 jul 14;10(1):11568. [4] justus cr, et al. transwell in vitro cell migration and invasion assays. methods mol biol. 2023;2644:349-359. [5] zhu y,et al. exosomal mmp-1 transfers metastasis potential in triple-negative breast cancer through par1-mediated emt. breast cancer res treat. 2022 may;193(1):65-81. |
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