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18317190548新蟲 (小有名氣)
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細胞侵襲，血管生成，"膠" 你做實驗！ | MedChemExpress
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1971 年，judah folkman 教授提出 “腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管新生” 理論，認為新血管的形成對于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。血管生成和細胞侵襲怎樣設(shè)計實驗？想要具體實驗 protocol？ 一文帶你走進熱門實驗技術(shù)，為發(fā)表高分文獻提供新思路，“膠”你做實驗！ 基底膜是一層特化薄而柔韌的胞外基質(zhì) (無細胞薄膜狀結(jié)構(gòu))，位于上皮細胞基底面與深部結(jié)締組織間�；啄ぴ诎l(fā)育和傷口愈合時會發(fā)生退化及再生，它不僅為細胞和細胞層提供支持，也為血管生成提供其所必需的環(huán)境，還是轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞侵襲的主要屏障。此外，基底膜還可通過影響細胞粘附、遷移、增殖和分化對組織形成產(chǎn)生重要作用[1]。 圖 1. 間質(zhì)基質(zhì)和基底膜的組成[1]。 基底膜基質(zhì)膠 (basement membrane matrix) 是從富含胞外基質(zhì)蛋白的小鼠腫瘤中提取出的天然基底膜基質(zhì)，主要成分是各類生長因子及細胞外基質(zhì)成分。 tips! 基質(zhì)膠主要細胞外基質(zhì)成分有：層粘連蛋白 (laminin)、iv 型膠原蛋白 (col-iv)、巢蛋白 (entactin)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖 (heparan sulphate proteoglycans) 等。 基質(zhì)膠也包含多種生長因子，例如：類胰島素生長因子 (igf-1)、轉(zhuǎn)化生長因子 β (tgf-β)、血管內(nèi)皮生長因子 (vegf)、表皮生長因子 (egf)、成纖維細胞生長因子 (bfgf) 等。 基于基底膜基質(zhì)膠的組成及特性，基底膜基質(zhì)膠對于體外模擬細胞體內(nèi)生長環(huán)境提供了非常重要的支持，其應用包括免疫缺陷型小鼠體內(nèi)腫瘤形成、類器官培養(yǎng)、腫瘤細胞侵襲實驗、體外和體內(nèi)血管生成研究、干細胞的維持、擴增和分化等。 腫瘤組織具有高度血管化的特征，腫瘤的生長依賴于新生血管。由于血管生成 (angiogenesis) 對腫瘤生長和侵入轉(zhuǎn)移、特別對腫瘤早期發(fā)生的重要影響，已成為近年來腫瘤研究的熱點之一。 由于內(nèi)皮細胞在基底膜提取物上培養(yǎng)時可形成三維毛細血管樣管狀結(jié)構(gòu)，血管生成實驗成為一種簡單、定量、可靠且功能強大的模型，常用于研究抑制劑和激活劑對血管生成的影響。 ▐【實驗步驟】 1. 準備基質(zhì)膠 實驗前一天將 -20℃ 保存的基質(zhì)膠埋于碎冰放入 4 ℃ 冰箱，使基質(zhì)膠過夜緩慢融化。實驗開始前，將基質(zhì)膠放在冰盒中，將 96 孔板和 1 ml 槍頭放置在冰上預冷，基質(zhì)膠用預冷槍頭混勻。 2. 鋪基質(zhì)膠 準備預冷的 1.5 ml 離心管用于稀釋基質(zhì)膠，以基質(zhì)膠: dmem 培養(yǎng)基為 1:1 或 2:1 的稀釋比稀釋。稀釋后向 96 孔板每孔加入 50-80 μl 稀釋后的基質(zhì)膠，垂直加入避免產(chǎn)生氣泡。在 37℃ 培養(yǎng)箱中放置 45 分鐘~1 小時使基質(zhì)膠凝固。 3. 鋪細胞 使用 3-5 代狀態(tài)較好的 huvec 細胞，消化細胞，用含 10% 血清的 dmem 培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)。96 孔板每孔加入 50-100 μl，3-5 萬個細胞的重懸液，每組重復三孔。將 96 孔板置于 37℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4-12 小時后可見血管形成。 4. 定量分析 使用 imagej 中 angiogenesis analyzer 插件對血管網(wǎng)絡(luò)進行定量統(tǒng)計。 ▐【結(jié)果示例圖】 圖 2. huvec 細胞血管形成實驗[2][3]。 ▐【注意事項】 1. 為什么基質(zhì)膠液面不平有氣泡？ 鋪膠時手持移液槍垂直于 96 孔板內(nèi)孔的正上方垂直加入，防止基質(zhì)膠沾到孔壁上。當剛加膠時出現(xiàn)明顯的氣泡，可使用吸頭輕觸戳破，后續(xù)搖平即可。若孔底部沒有鋪勻，可晃動孔板使其均勻鋪于底部。 2. 成管時間怎么判斷？ 成管時間與細胞狀態(tài)密切相關(guān)。細胞狀態(tài)好時，2-3 小時開始成管，細胞狀態(tài)較差時，可能 18-24 h 成管；如果使用原代內(nèi)皮細胞而非永生化細胞，開始成管的時間會延遲幾個小時；建議首次實驗每 4 個小時觀察一次。 細胞侵襲 (cell invasion) 是指細胞通過細胞外基質(zhì)從一個區(qū)域遷移到另一個區(qū)域的能力，是正常細胞或癌細胞對化學和機械刺激做出的正常反應，通常發(fā)生在胚胎發(fā)育、血管生成、傷口修復、炎癥反應、免疫反應和癌癥轉(zhuǎn)移等過程中。 圖 3. transwell 細胞侵襲試驗示意圖[4]。 在腫瘤相關(guān)研究中，利用 transwell 小室檢測腫瘤細胞的遷移和侵襲能力十分常見。在 transwell 小室的聚碳酸酯膜上側(cè)鋪一層基質(zhì)膠模擬細胞外基質(zhì)，腫瘤細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶消化基質(zhì)進入下室，最后計算下室的細胞量即可反映細胞的侵襲能力。 ▐【實驗步驟】 1. 準備基質(zhì)膠 實驗前一天將 -20℃ 保存的基質(zhì)膠埋于碎冰放入 4℃ 冰箱，使基質(zhì)膠過夜緩慢融化。實驗開始前，將基質(zhì)膠放在冰盒中，將 24 孔板和 1 ml 槍頭放置在冰上預冷，基質(zhì)膠用預冷槍頭混勻。 2. 鋪基質(zhì)膠 準備預冷的 1.5 ml 離心管用于稀釋基質(zhì)膠，以基質(zhì)膠: dmem 培養(yǎng)基為 1:8 的稀釋比稀釋 (根據(jù)細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶的含量，稀釋比例需要摸索)。取 60-100 μl基質(zhì)膠添加到 transwell 小室上層 (注意不要出現(xiàn)氣泡)，于 37℃ 培養(yǎng)箱中孵育 3 h，使基質(zhì)膠聚合成薄膜。孵育后將上室中多余液體吸掉，每孔加入 100 μl 無血清培養(yǎng)基后，于 37℃ 培養(yǎng)箱放置 30 min，進行基底膜水化。 3. 鋪細胞 在 24 孔板下室加入 600 μl 含有 10% 胎牛血清的細胞培養(yǎng)基。消化細胞，用 pbs 清洗細胞，使用含有 bsa 的無血清培養(yǎng)基重新懸浮細胞，細胞計數(shù)調(diào)整細胞密度至 1-10×105個/ml (不同細胞大小和侵襲能力不同，可設(shè)置濃度梯度以達到最佳實驗結(jié)果)。用鑷子將 transwell 小室置于 24 孔板內(nèi) (注意不要產(chǎn)生氣泡)，取 100-200 μl 細胞懸液，加入 transwell 小室上層。將 24 孔板置于 37℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24-72 h (依照細胞侵襲能力而定)。 4. 結(jié)晶紫染色 棄去細胞培養(yǎng)基，24 孔板加入 500 μl 4% 多聚甲醛固定液固定 30 分鐘，pbs 清洗。加入 500 μl 結(jié)晶紫溶液，染色 30 分鐘，使用 pbs 清洗去除浮液。適當風干后即可進行顯微鏡觀察、拍照和統(tǒng)計學分析。 ▐【結(jié)果示例圖】 圖 4. mda-231 細胞和 mda-231-hm 細胞的侵襲實驗[5]。 ▐【注意事項】 1. 結(jié)晶紫染色后細胞分布不均一？ 可能原因：transwell 小室傾斜放置在孔板中；細胞消化不完全；細胞懸液添加不均勻；基質(zhì)膠膠面不均勻。 2. transwell 小室下層細胞過少？ 可能原因：細胞的侵襲能力弱；基質(zhì)膠濃度偏高厚度偏厚；細胞接種數(shù)量少；transwell 小室孔徑偏�。籺ranswell 小室放入孔板時有氣泡等。 歡迎留言投稿！ 本期為大家介紹了血管生成和細胞侵襲的實驗設(shè)計和注意事項，各位小伙伴們！或許你有其他想要了解的實驗 protocol？ 小 m 歡迎大家留言評論，安排您的 “專屬” 實驗操作指南或相關(guān)主題講座喔~ mce 的所有產(chǎn)品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。 參考文獻： [1] bonnans c, et al. remodelling the extracellular matrix in development and disease. nat rev mol cell biol. 2014 dec;15(12):786-801. [2] dai x, et al. aspirin inhibits cancer metastasis and angiogenesis via targeting heparanase. clin cancer res. 2017 oct 15;23(20):6267-6278. [3] carpentier g,et al. angiogenesis analyzer for imagej - a comparative morphometric analysis of "endothelial tube formation assay" and "fibrin bead assay". sci rep. 2020 jul 14;10(1):11568. [4] justus cr, et al. transwell in vitro cell migration and invasion assays. methods mol biol. 2023;2644:349-359. [5] zhu y,et al. exosomal mmp-1 transfers metastasis potential in triple-negative breast cancer through par1-mediated emt. breast cancer res treat. 2022 may;193(1):65-81. |
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