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LUCINA*新蟲 (初入文壇)
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請教關(guān)于轉(zhuǎn)染的若干問題
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我最近在進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用的是QIAGEN品牌的Attractene轉(zhuǎn)染試劑，體系按照說明書配置的，轉(zhuǎn)染六孔板，結(jié)果在WB后發(fā)現(xiàn)檢不出標(biāo)簽。這個(gè)基因是之前師兄探索過的一個(gè)基因，表達(dá)應(yīng)該是沒有問題的。用了了Abways和Abclonal的一抗都不行。也轉(zhuǎn)過GFP標(biāo)簽顯微鏡下熒光很低，就是沒轉(zhuǎn)進(jìn)去。后來換了碧云天的lipo6000轉(zhuǎn)染試劑和CST抗體就可以檢出來。但是我?guī)熜终f他之前用的是Abways的抗體，我現(xiàn)在用這個(gè)品牌抗體孵不出就是有問題，懷疑我檢出來的就不是那個(gè)基因。 而且最近我用CST抗體孵育發(fā)現(xiàn)空載也有帶（大哭！） 有懂轉(zhuǎn)染的同學(xué)解答一下嗎（球球） 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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Glenice Y
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但是我感覺主要問題出在你的轉(zhuǎn)染上面了，我們用的thermo的lipo兩千 之前也用過國產(chǎn)的 轉(zhuǎn)質(zhì)�；径急磉_(dá)量很高，沒有出現(xiàn)你上述情況過。CST的抗體確實(shí)比其他的好點(diǎn)，我們也用過這個(gè)牌子。但是空載也有帶的話，那你這完全不能說明什么了。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2023-11-03 00:18:38
Glenice Y
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首先就要排除你是否轉(zhuǎn)進(jìn)去了，正常你需要對照，就像你的GFP理論上是同一個(gè)載體，只有這個(gè)蛋白這個(gè)區(qū)域不同。另外WB需要內(nèi)參，那樣起碼能夠證明WB整個(gè)流程什么的沒有問題，同時(shí)包括提蛋白的過程。另外你說熒光很低，那就側(cè)面說明表達(dá)量不高。但是理論上只要有表達(dá)，WB也能檢測出來。如果沒有目的帶，檢查一抗，或者提高一抗比例，然后就是顯影的時(shí)候調(diào)長時(shí)間，跑膠的時(shí)候盡量多上點(diǎn)樣。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2023-11-03 00:16:25
Glenice Y
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另外，你說理論上表達(dá)沒有問題，其實(shí)我不太贊同，你可以拿這個(gè)沾染的質(zhì)粒測一下序，看看是否出現(xiàn)移碼突變等等情況，這種都可能存在的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2023-11-03 00:20:39
LUCINA*
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謝謝大佬，這個(gè)質(zhì)粒我們也測過序了，沒發(fā)現(xiàn)有突變，別人轉(zhuǎn)染效果也不太好。后來換了HA標(biāo)簽就好多了。但是也沒有別人的表達(dá)量高。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2023-11-15 20:09:32
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