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請教關于轉(zhuǎn)染的若干問題
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我最近在進行轉(zhuǎn)染，用的是QIAGEN品牌的Attractene轉(zhuǎn)染試劑，體系按照說明書配置的，轉(zhuǎn)染六孔板，結(jié)果在WB后發(fā)現(xiàn)檢不出標簽。這個基因是之前師兄探索過的一個基因，表達應該是沒有問題的。用了了Abways和Abclonal的一抗都不行。也轉(zhuǎn)過GFP標簽顯微鏡下熒光很低，就是沒轉(zhuǎn)進去。后來換了碧云天的lipo6000轉(zhuǎn)染試劑和CST抗體就可以檢出來。但是我?guī)熜终f他之前用的是Abways的抗體，我現(xiàn)在用這個品牌抗體孵不出就是有問題，懷疑我檢出來的就不是那個基因。 而且最近我用CST抗體孵育發(fā)現(xiàn)空載也有帶（大哭�。� 有懂轉(zhuǎn)染的同學解答一下嗎（球球） 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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Glenice Y
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首先就要排除你是否轉(zhuǎn)進去了，正常你需要對照，就像你的GFP理論上是同一個載體，只有這個蛋白這個區(qū)域不同。另外WB需要內(nèi)參，那樣起碼能夠證明WB整個流程什么的沒有問題，同時包括提蛋白的過程。另外你說熒光很低，那就側(cè)面說明表達量不高。但是理論上只要有表達，WB也能檢測出來。如果沒有目的帶，檢查一抗，或者提高一抗比例，然后就是顯影的時候調(diào)長時間，跑膠的時候盡量多上點樣。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2023-11-03 00:16:25
Glenice Y
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但是我感覺主要問題出在你的轉(zhuǎn)染上面了，我們用的thermo的lipo兩千 之前也用過國產(chǎn)的 轉(zhuǎn)質(zhì)粒基本都表達量很高，沒有出現(xiàn)你上述情況過。CST的抗體確實比其他的好點，我們也用過這個牌子。但是空載也有帶的話，那你這完全不能說明什么了。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2023-11-03 00:18:38
Glenice Y
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另外，你說理論上表達沒有問題，其實我不太贊同，你可以拿這個沾染的質(zhì)粒測一下序，看看是否出現(xiàn)移碼突變等等情況，這種都可能存在的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2023-11-03 00:20:39
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謝謝大佬，這個質(zhì)粒我們也測過序了，沒發(fā)現(xiàn)有突變，別人轉(zhuǎn)染效果也不太好。后來換了HA標簽就好多了。但是也沒有別人的表達量高。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2023-11-15 20:09:32
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