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Milkttttea新蟲 (初入文壇)
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[求助]
無縫克隆連不上
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用的維諾贊的C112無縫克隆試劑盒，不太清楚問題出在哪了，載體酶切膠回收濃度28ng/ul，片段特意條帶柱回收33.8ng/ul，按說明書用的1:2比例（0.03:0.06pmol），37度pcr儀反應(yīng)30min，冰上冷卻就轉(zhuǎn)化了，用的takara的DH5a，冰浴30min，45s熱激，冰浴2min，無抗soc搖1h，5000rpm離心5min，留100ul重懸涂板。 最后沒有一個克隆長出來。 設(shè)計的引物F端的15bp同源臂GC含量高一點有67%，R端剛好40%，不知道是不是問題在這，或者說感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率的問題，把熱激時間提高到90s？或者說把重組時間提高到1h？ 再或者說重新設(shè)計F端同源臂，我看了22bp的同源臂才是低于60%GC @youlinglyw 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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3樓2022-08-20 16:38:21
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