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719600567鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助關于WB重復性差的問題。 已有2人參與
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我跑sd大鼠胰腺組織的yap及p-yap蛋白（65-78kd）的wb已經有好幾個月了，期間偶爾跑出過一兩次，但是重復性很差，經常是空白條帶或者是一片灰。 關于我跑wb的一些細節(jié)。 1.用的是10%的膠，上樣量是20微； 2.nc膜，轉膜條件100v，100min，轉膜后麗春紅染色可以看見條帶； 3.5%脫脂牛奶室溫封閉1.5-2h； 4.一抗用的是cst的抗體按說明書配的1:1000，4攝氏度孵育過夜； 5.tbst洗5min*3次； 6.二抗用過1：1000和1：500的感覺差不多，該出不來還是出不來，確定種屬是沒有加錯的； 7.tbst10min*3次； 8.ecl反應三分鐘膠片曝光，壓過半小時也還是沒有，內參是有的。 想發(fā)圖，但是這個論壇真的很難用誒？！ |
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【答案】應助回帖
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1、上樣量不應該用ul來衡量，因為蛋白濃度有濃有稀，對于難跑的指標首先可以考慮加大上樣量，比如50ug，這50ug對應多少ul取決于你BCA獲得的濃度，計算出來的，所以建議在提蛋白的時候盡量讓蛋白濃度高一些，我一般會達到5-10ug/ul。 2、跑不出來可能真的是表達量低，可以用過QPCR看一下YAP在你的樣本里的表達水平，同時可以網上uniport等蛋白庫里找一下YAP在胰腺里的表達量 3、CST的抗體也不見得每個都好用，如果以上兩點都確認過，可以考慮換個牌子試試，也可以發(fā)郵件找CST的技術支持，把你的實驗條件和圖片發(fā)過去，一方面尋求建議，一方面也可以要求售后 |
7樓2024-09-01 15:22:14
劉楠楠05
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2樓2022-01-18 22:57:35
719600567
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- 專業(yè): 胰腺外分泌功能異常與胰腺
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1:1000比1:5000濃度要高吧，但就算是這樣也曝不出來；20微應該很夠了吧，再怎么說也不應該什么都沒有；因為是cst的抗體，所以還是很信任的，這個建議有待嘗試，謝謝。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2022-01-19 07:50:42
劉楠楠05
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4樓2022-01-19 09:10:45
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