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| 【懸賞金幣】回答本帖問(wèn)題，作者719600567將贈(zèng)送您 5 個(gè)金幣 | ||
719600567鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
求助關(guān)于WB重復(fù)性差的問(wèn)題。 已有2人參與
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我跑sd大鼠胰腺組織的yap及p-yap蛋白（65-78kd）的wb已經(jīng)有好幾個(gè)月了，期間偶爾跑出過(guò)一兩次，但是重復(fù)性很差，經(jīng)常是空白條帶或者是一片灰。 關(guān)于我跑wb的一些細(xì)節(jié)。 1.用的是10%的膠，上樣量是20微； 2.nc膜，轉(zhuǎn)膜條件100v，100min，轉(zhuǎn)膜后麗春紅染色可以看見(jiàn)條帶； 3.5%脫脂牛奶室溫封閉1.5-2h； 4.一抗用的是cst的抗體按說(shuō)明書配的1:1000，4攝氏度孵育過(guò)夜； 5.tbst洗5min*3次； 6.二抗用過(guò)1：1000和1：500的感覺(jué)差不多，該出不來(lái)還是出不來(lái)，確定種屬是沒(méi)有加錯(cuò)的； 7.tbst10min*3次； 8.ecl反應(yīng)三分鐘膠片曝光，壓過(guò)半小時(shí)也還是沒(méi)有，內(nèi)參是有的。 想發(fā)圖，但是這個(gè)論壇真的很難用誒？！ |
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劉楠楠05
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2樓2022-01-18 22:57:35
719600567
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1:1000比1:5000濃度要高吧，但就算是這樣也曝不出來(lái)；20微應(yīng)該很夠了吧，再怎么說(shuō)也不應(yīng)該什么都沒(méi)有；因?yàn)槭莄st的抗體，所以還是很信任的，這個(gè)建議有待嘗試，謝謝。 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
3樓2022-01-19 07:50:42
劉楠楠05
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4樓2022-01-19 09:10:45
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5樓2022-01-25 20:42:27
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【答案】應(yīng)助回帖
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1、上樣量不應(yīng)該用ul來(lái)衡量，因?yàn)榈鞍诐舛扔袧庥邢�，�?duì)于難跑的指標(biāo)首先可以考慮加大上樣量，比如50ug，這50ug對(duì)應(yīng)多少ul取決于你BCA獲得的濃度，計(jì)算出來(lái)的，所以建議在提蛋白的時(shí)候盡量讓蛋白濃度高一些，我一般會(huì)達(dá)到5-10ug/ul。 2、跑不出來(lái)可能真的是表達(dá)量低，可以用過(guò)QPCR看一下YAP在你的樣本里的表達(dá)水平，同時(shí)可以網(wǎng)上uniport等蛋白庫(kù)里找一下YAP在胰腺里的表達(dá)量 3、CST的抗體也不見(jiàn)得每個(gè)都好用，如果以上兩點(diǎn)都確認(rèn)過(guò)，可以考慮換個(gè)牌子試試，也可以發(fā)郵件找CST的技術(shù)支持，把你的實(shí)驗(yàn)條件和圖片發(fā)過(guò)去，一方面尋求建議，一方面也可以要求售后 |
7樓2024-09-01 15:22:14
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