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mxc137新蟲 (初入文壇)
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[交流]
關(guān)于滾環(huán)擴(kuò)增的問題求助
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我最近在做滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物與帶有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的莖環(huán)序列雜交的實(shí)驗(yàn)，通過讓莖環(huán)打開，來實(shí)現(xiàn)信號的放大。但是我試了很多辦法，幾乎檢測不到信號，甚至實(shí)驗(yàn)組比空白實(shí)驗(yàn)信號還要低。我檢查了序列配對，沒有任何問題。而我通過讓莖環(huán)序列與它互補(bǔ)的單鏈結(jié)合，就會產(chǎn)生明顯的信號，證明莖環(huán)序列是沒有問題的。 我覺得是莖環(huán)序列沒有與滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合上。 所以希望各位能給點(diǎn)建議或指導(dǎo)，是什么原因?qū)е碌倪@個問題，或者說大家有什么意見或者建議，感謝大家的幫助和指導(dǎo)。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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pennchem
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2樓2022-01-14 12:13:34
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結(jié)合上的話，熒光團(tuán)會遠(yuǎn)離猝滅團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號。擴(kuò)增成功的表現(xiàn)是可以通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，觀察到有明亮條帶。目前是，有正確的條帶，但是加入莖環(huán)序列后經(jīng)過檢測沒有信號。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2022-01-14 14:41:46
pennchem
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4樓2022-01-14 15:52:19
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5樓2022-01-14 16:03:10
pennchem
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如果是phi29的話，反應(yīng)溫度是30°C？ 探針和單鏈DNA結(jié)合也是這樣的溫度么？ 反應(yīng)體系中有沒有加入單鏈DNA結(jié)合蛋白？能否將反應(yīng)產(chǎn)物純化后，再加入探針看是否產(chǎn)生熒光？ 反應(yīng)是實(shí)時熒光（是不是觀察窗口期太短），如果是反應(yīng)結(jié)束后再加入探針觀察，有沒有可能反應(yīng)時間太長，里面的單鏈已經(jīng)不是單鏈（非特異擴(kuò)增） 還有是否序列是否反過來了，探針和序列一致，而非互補(bǔ)（可能性很小，但也需排除） |
6樓2022-01-14 17:20:17
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溫度是相近的，不過沒有加入單鏈DNA結(jié)合蛋白，因?yàn)樾枰M(jìn)一步反應(yīng)，連接熒光序列。我在想，能不能在進(jìn)行進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)開始時，加入熒光序列，會不會好一些。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2022-01-16 21:50:29
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