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Dusk_star新蟲 (初入文壇)
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[求助]
[求助]定點(diǎn)突變pcr產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化后提不出質(zhì)粒
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最近在做定點(diǎn)突變，設(shè)計(jì)上下游引物30bp左右，突變位點(diǎn)在中間，目的基因3300bp，加質(zhì)�？傞L(zhǎng)9000bp左右。 PCR之后用DpnⅠ消除模板，轉(zhuǎn)化JM109或BL21，然后挑菌送測(cè)序。最近總出現(xiàn)挑到的菌提質(zhì)粒濃度很低是（三四十左右），送不了測(cè)序的那種，偶爾提出質(zhì)粒濃度正常的還是模板情況。 而且我發(fā)現(xiàn)這種提不出質(zhì)粒的情況不管IM109還是BL21都會(huì)出現(xiàn)，在提質(zhì)粒過(guò)程中，加完P(guān)3 buffer混勻后，雖然有絮狀沉淀但是液體渾濁（正常加完P(guān)3后，出現(xiàn)絮狀沉淀，液體澄清透亮）。 之前也做了一批突變，還算正常。最近做的時(shí)候就總出現(xiàn)，想不到哪里出了問(wèn)題。 |
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小汰寶
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1. 像樓上所說(shuō)，用DH5α試試。JM109不了解，但是做突變轉(zhuǎn)BL21的話效率很低 2. 環(huán)P質(zhì)粒9000bp成功率也比較低。這么長(zhǎng)質(zhì)粒上的定點(diǎn)突變我一般只p個(gè)小幾百bp的片段做突變，同時(shí)p剩下的載體部分最后做同源重組。麻煩是麻煩一些，但是成功率非常高 3. 你對(duì)9000bp質(zhì)粒環(huán)p后看過(guò)膠圖嗎？目標(biāo)條帶應(yīng)該不濃吧？你非要大質(zhì)粒環(huán)p的話可以加甘油/dmso試下 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2022-03-03 19:24:22
tmoonday
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2樓2021-12-09 22:40:23
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4樓2022-08-12 00:33:47
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