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Dusk_star新蟲 (初入文壇)
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[求助]
[求助]定點突變pcr產(chǎn)物，轉化后提不出質粒
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最近在做定點突變，設計上下游引物30bp左右，突變位點在中間，目的基因3300bp，加質粒總長9000bp左右。 PCR之后用DpnⅠ消除模板，轉化JM109或BL21，然后挑菌送測序。最近總出現(xiàn)挑到的菌提質粒濃度很低是（三四十左右），送不了測序的那種，偶爾提出質粒濃度正常的還是模板情況。 而且我發(fā)現(xiàn)這種提不出質粒的情況不管IM109還是BL21都會出現(xiàn)，在提質粒過程中，加完P3 buffer混勻后，雖然有絮狀沉淀但是液體渾濁（正常加完P3后，出現(xiàn)絮狀沉淀，液體澄清透亮）。 之前也做了一批突變，還算正常。最近做的時候就總出現(xiàn)，想不到哪里出了問題。 |
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tmoonday
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2樓2021-12-09 22:40:23
小汰寶
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1. 像樓上所說，用DH5α試試。JM109不了解，但是做突變轉BL21的話效率很低 2. 環(huán)P質粒9000bp成功率也比較低。這么長質粒上的定點突變我一般只p個小幾百bp的片段做突變，同時p剩下的載體部分最后做同源重組。麻煩是麻煩一些，但是成功率非常高 3. 你對9000bp質粒環(huán)p后看過膠圖嗎？目標條帶應該不濃吧？你非要大質粒環(huán)p的話可以加甘油/dmso試下 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2022-03-03 19:24:22
L_大松子
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4樓2022-08-12 00:33:47
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