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小汰寶金蟲 (正式寫手)
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[求助]
RBS+第一個蛋白（有終止密碼子）+第二個蛋白（有終止密碼子），會正常表達(dá)嗎？ 已有1人參與
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想構(gòu)建2個蛋白在pet28a載體上。序列大概是： T7啟動子——RBS——第一個蛋白（有終止密碼子）——78bp （血清酶切割位點和T7 tag）——第二個蛋白（有終止密碼子） 第二個蛋白前是沒有RBS的 請問這樣第二個蛋白能正常表達(dá)嗎？還是第二個蛋白表達(dá)量會少一點？還是第二個蛋白因為沒有RBS所以根本不會有表達(dá)？ 求助，感謝。 |
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pennchem
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4樓2021-02-06 10:29:19
pennchem
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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翻譯蛋白，需要核糖體結(jié)合mRNA 如果沒有核糖體結(jié)合位點（ribosome binding site），核糖體結(jié)合的可能性會低很多，意味著蛋白表達(dá)的可能性會低很多。 現(xiàn)在有很多雙表達(dá)的質(zhì)粒，插入MCS1和MCS2就可以同時表達(dá)兩個基因。 或者只有一個RBS，但是第一個基因以TAA結(jié)尾，第二個基因以ATG開頭，中間重合一個A，TAATG，核糖體在翻譯完第一個基因后，距離第二個基因很近，也能把第二個基因翻譯了。事實上，很多病毒基因就是這么排列的。 以上只是分析，一切還是看實驗結(jié)果。你的第二個基因表達(dá)了么？ |
2樓2021-02-06 10:03:07
小汰寶
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太感謝了！ 我是在構(gòu)建一個融合蛋白突變庫的時候，找到一個突變體，效果特別好，但是測序發(fā)現(xiàn)這個突變體序列在in fusion連接的時候發(fā)生了錯配，完全沒有按我們預(yù)計的走，卻表現(xiàn)出了較高的蛋白2的酶活和極少的包涵體，所以很困惑。 設(shè)計的融合蛋白突變庫的構(gòu)建： T7啟動子——RBS——第一個蛋白做隨機突變（無終止密碼子）——78bp （血清酶切割位點和T7 tag）——第二個蛋白（有終止密碼子） 找到的這個的hit: T7啟動子——RBS——第一個蛋白，有隨機突變，但是大約只有原蛋白前3/4部分（有終止密碼子）——78bp （血清酶切割位點和T7 tag）——第一個蛋白有隨機突變，但是大約只有原蛋白前1/2部分（無終止密碼子）——78bp （血清酶切割位點和T7 tag）——第二個蛋白（有終止密碼子） 這個hit等于變成了我題目中問的那個樣子。 測序應(yīng)該沒有問題，此序列來自雙向測序結(jié)果。 這個hit做蛋白2的催化，表現(xiàn)非常好�，F(xiàn)在不知道怎么解釋這個機理機制，畢竟原以為發(fā)生這種錯連的突變，蛋白2應(yīng)該沒表達(dá)才對。 |
3樓2021-02-06 10:17:15
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