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小汰寶金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
RBS+第一個(gè)蛋白（有終止密碼子）+第二個(gè)蛋白（有終止密碼子），會(huì)正常表達(dá)嗎？ 已有1人參與
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想構(gòu)建2個(gè)蛋白在pet28a載體上。序列大概是： T7啟動(dòng)子——RBS——第一個(gè)蛋白（有終止密碼子）——78bp （血清酶切割位點(diǎn)和T7 tag）——第二個(gè)蛋白（有終止密碼子） 第二個(gè)蛋白前是沒(méi)有RBS的 請(qǐng)問(wèn)這樣第二個(gè)蛋白能正常表達(dá)嗎？還是第二個(gè)蛋白表達(dá)量會(huì)少一點(diǎn)？還是第二個(gè)蛋白因?yàn)闆](méi)有RBS所以根本不會(huì)有表達(dá)？ 求助，感謝。 |
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小汰寶
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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太感謝了！ 我是在構(gòu)建一個(gè)融合蛋白突變庫(kù)的時(shí)候，找到一個(gè)突變體，效果特別好，但是測(cè)序發(fā)現(xiàn)這個(gè)突變體序列在in fusion連接的時(shí)候發(fā)生了錯(cuò)配，完全沒(méi)有按我們預(yù)計(jì)的走，卻表現(xiàn)出了較高的蛋白2的酶活和極少的包涵體，所以很困惑。 設(shè)計(jì)的融合蛋白突變庫(kù)的構(gòu)建： T7啟動(dòng)子——RBS——第一個(gè)蛋白做隨機(jī)突變（無(wú)終止密碼子）——78bp （血清酶切割位點(diǎn)和T7 tag）——第二個(gè)蛋白（有終止密碼子） 找到的這個(gè)的hit: T7啟動(dòng)子——RBS——第一個(gè)蛋白，有隨機(jī)突變，但是大約只有原蛋白前3/4部分（有終止密碼子）——78bp （血清酶切割位點(diǎn)和T7 tag）——第一個(gè)蛋白有隨機(jī)突變，但是大約只有原蛋白前1/2部分（無(wú)終止密碼子）——78bp （血清酶切割位點(diǎn)和T7 tag）——第二個(gè)蛋白（有終止密碼子） 這個(gè)hit等于變成了我題目中問(wèn)的那個(gè)樣子。 測(cè)序應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，此序列來(lái)自雙向測(cè)序結(jié)果。 這個(gè)hit做蛋白2的催化，表現(xiàn)非常好。現(xiàn)在不知道怎么解釋這個(gè)機(jī)理機(jī)制，畢竟原以為發(fā)生這種錯(cuò)連的突變，蛋白2應(yīng)該沒(méi)表達(dá)才對(duì)。 |
3樓2021-02-06 10:17:15
pennchem
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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翻譯蛋白，需要核糖體結(jié)合mRNA 如果沒(méi)有核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosome binding site），核糖體結(jié)合的可能性會(huì)低很多，意味著蛋白表達(dá)的可能性會(huì)低很多。 現(xiàn)在有很多雙表達(dá)的質(zhì)粒，插入MCS1和MCS2就可以同時(shí)表達(dá)兩個(gè)基因。 或者只有一個(gè)RBS，但是第一個(gè)基因以TAA結(jié)尾，第二個(gè)基因以ATG開(kāi)頭，中間重合一個(gè)A，TAATG，核糖體在翻譯完第一個(gè)基因后，距離第二個(gè)基因很近，也能把第二個(gè)基因翻譯了。事實(shí)上，很多病毒基因就是這么排列的。 以上只是分析，一切還是看實(shí)驗(yàn)結(jié)果。你的第二個(gè)基因表達(dá)了么？ |
2樓2021-02-06 10:03:07
pennchem
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4樓2021-02-06 10:29:19
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