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化合物肝臟毒性體外細(xì)胞評價
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一、肝臟毒性簡介 肝臟是人類與動物最重要的器官之一，它擔(dān)任著代謝與解毒兩大最主要的功能，但它極容易遭受到多種因素的損傷（如：肝炎病毒、藥物毒性、食物發(fā)霉或酒精等）。由這些因素引發(fā)的急性肝損傷（Acute liver failure，ALF）會導(dǎo)致肝細(xì)胞大面積壞死或凋亡、肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激，甚至肝功能損害，它是一種嚴(yán)重的疾病并伴有較高的死亡率。因此，采取有效改善肝臟損傷的措施，可能對肝臟疾病的防治起到至關(guān)重要作用。 至今，藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）仍然是全球一項嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，而由對乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）誘導(dǎo)的 ALF 占其主導(dǎo)地位。過量的 APAP 在肝臟經(jīng)過一系列的反應(yīng)，會產(chǎn)生大量活性氧（ROS）引起肝臟嚴(yán)重的氧化損傷，最終導(dǎo)致急性肝損傷。因此，抑制過度的炎癥反應(yīng)和劇烈的氧化應(yīng)激在防治這兩種肝損傷的致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。 藥物中毒不僅是歐洲國家是主要導(dǎo)致急性肝損傷的因素，在我國也是主要引起急性肝損傷的原因。據(jù)統(tǒng)計，在美國，藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）患者在總急性肝衰竭患者中占有約 57 %的比例，在英國（占 51 %），而在蘇格蘭高達(dá) 75 %。在我國，據(jù)全國多中心急性藥物性肝損傷住院病歷調(diào)查分析結(jié)果顯示，急性藥物性肝損傷的發(fā)病率呈逐年增加趨勢。 二、肝臟毒性機(jī)理 在藥物中毒引起的急性肝損傷中，由對乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）導(dǎo)致的急性肝損傷占其主導(dǎo)地位。在治療劑量下，APAP大部分被二磷酸尿核苷（UDP）葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT）和硫酸基轉(zhuǎn)移酶（SULT）等 II 期代謝酶代謝成無毒化合物，隨尿液排出。只有很小一部分以不變的方式排泄在尿液中。其余約 5-9 %APAP 由細(xì)胞色素 P450 酶（CYPs）代謝，主要由 CYP2E1 轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)性的中間代謝物 N-乙酰苯亞胺基醌（NAPQI）。一般來說，NAPQI 通過與谷胱甘肽（GSH）結(jié)合而迅速解毒。然而，當(dāng) APAP 過量時會導(dǎo)致 II 期代謝酶飽和，產(chǎn)生過量的 NAPQI 會使谷胱甘肽（glutathione，GSH）消耗殆盡，從而剩下的 NAPQI 則會與細(xì)胞膜分子發(fā)生反應(yīng)，尤其與線粒體蛋白中巰基的共價結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激和功能障礙，最終引起肝細(xì)胞壞死。 急性肝損傷（ALF）的致病機(jī)制極為復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激、線粒體功能失調(diào)、炎癥反應(yīng)以及自噬等與其都有著密切的關(guān)聯(lián)。 氧化應(yīng)激是指體內(nèi)的氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡失調(diào)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）過度積累從而導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷。在 APAP 誘導(dǎo)的急性肝損傷過程中，過多的 APAP 被細(xì)胞色素 P450 酶代謝成 NAPQI，它的過度積累進(jìn)而干擾線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物 I/II（ETC），導(dǎo)致電子從 ETC 向氧泄漏，形成超氧自由基。超氧化物自由基一旦形成，就會在線粒體中被錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）分解成H2O2和O2，或與內(nèi)源性NO反應(yīng)形成過氧亞硝基（ONOO−）。然而，H2O2能夠被肝細(xì)胞中的 GSH、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、過氧化物還原酶（peroxiredoxin，Prx）等多種抗氧化酶清除。同時，線粒體中形成的 ONOO−也可與 GSH 反應(yīng)，從而被清除。由于這些過量的自由基會導(dǎo)致 GSH 耗竭，引起 ONOO−的積累，進(jìn)而使硝基酪氨酸蛋白加合物的形成，最終引發(fā)線粒體 DNA 的損傷和肝毒性。目前，N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）是臨床上治療 APAP 誘導(dǎo)的 ALF 在用的解毒劑，它主要通過補(bǔ)充 GSH 來增強(qiáng) NAPQI 的解毒作用。但是，該藥物還存在一些缺陷，比如副作用和治療窗口狹窄等問題。一般來說，NAC 的不良反應(yīng)不會危及生命，但也會引起惡心、嘔吐和初始輸注時的過敏性反應(yīng)。同時，它的解毒效果，主要是針對 APAP 中毒前 8 小時，之后治療效果明顯開始下降。因此，探究一些有效治療 APAP 肝損傷的藥物和潛在靶標(biāo)，特別是對于那些在晚期出現(xiàn)的患者，仍然相當(dāng)需要。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多分子參與 APAP 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)，尤其是 Nrf2，這些分子可能是 APAP 誘導(dǎo)的 ALF 潛在的治療靶點。 在許多方面，炎癥是一種機(jī)體改善組織損傷和愈合的生理反應(yīng)。然而，炎癥過程的嚴(yán)重失衡會導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生及各種組織損傷。過度的炎癥反應(yīng)也是引發(fā) ALF 發(fā)生的主要原因之一。首先，多種炎性因子可以直接或間接的方式參與肝組織的損傷。如：腫瘤壞死因子（TNF-α）作為一種關(guān)鍵的炎性因子，不僅伴隨各種肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展，而且它的含量高低與肝臟疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。同時，TNF-α 能直接通過介導(dǎo) TNF-R1 誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡，或間接通過誘生多種細(xì)胞因子產(chǎn)生，并形成復(fù)雜的炎性因子網(wǎng)絡(luò)，加劇肝損傷的進(jìn)展。另外，白介素 1（IL-1）也是一種較強(qiáng)的促炎因子，它可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，并引發(fā)其他炎性因子的分泌，進(jìn)而參與炎性反應(yīng)。其次，IL-6 的生物學(xué)活性廣泛，能促進(jìn) B 細(xì)胞的增殖分化并產(chǎn)生抗體，增多免疫復(fù)合物的形成，并引起炎癥反應(yīng)和靶細(xì)胞的損傷。總之，這些炎性因子的過多產(chǎn)生會加重肝臟病理組織損傷。大量文獻(xiàn)報道，多種信號分子的激活（包括 NF-κB，MAPK 和 Txnip/NLRP3 炎性小體）參與炎癥反應(yīng)，在肝損傷中發(fā)揮著十分重要的作用。 自噬是一種分解代謝溶酶體降解過程，最早由 de Duve 和 Wattianux 在 50 年前發(fā)現(xiàn)于肝臟中。目前已發(fā)現(xiàn) 30 多個自噬相關(guān)（Atg）基因，它們通過多種信號通路調(diào)控自噬過程。在這個過程中，Beclin-1 結(jié)合于分隔膜，主要負(fù)責(zé)募集Atg 家族蛋白，使 Atg12-Atg5-Atg16 復(fù)合物形成，進(jìn)而促進(jìn)前自噬泡形成；進(jìn)一步募集 LC3-II 結(jié)合到分隔膜， 加速自噬體外膜的延展擴(kuò)張，導(dǎo)致Atg12-Atg5-Atg16 復(fù)合物的脫落，促進(jìn)成熟自噬體形成；自噬激活時 LC3-I型迅速轉(zhuǎn)化為 II 型，并定位于前自噬體和自噬體，在其他 Atg 脫落后，成為自噬體形成的標(biāo)志性分子。一旦自噬體與溶酶體融合，自噬體內(nèi)的 LC3-II 即被溶酶體中的水解酶降解。另外，AMPK 和 mTOR 激酶也是自噬的關(guān)鍵調(diào)控分子。目前，越來越多的證據(jù)支持自噬和細(xì)胞死亡之間的交叉作用。在應(yīng)激反應(yīng)中，細(xì)胞利用自噬作為一種生存機(jī)制，在饑餓過程中產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)，消滅入侵的病原體，清除受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，從而得以生存。在肝臟中，基礎(chǔ)自噬似乎是維持肝臟穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞存活的關(guān)鍵，因為小鼠肝臟中 Atg5 或 Atg7 基因缺失導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加，嚴(yán)重的肝腫大和肝損傷。 據(jù)大量研究表明，在急性肝損傷疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，有多種信號通路直接或間接參與肝損傷的調(diào)節(jié)。其中主要的信號通路有 TLR4-MAPK/-NF-κB，Txnip，NLRP3 炎性小體和 Nrf2 等。 三、肝臟毒性體外評價方法 目前肝細(xì)胞毒性仍主要采用傳統(tǒng)的評價技術(shù)和手段，在靈敏度和特異性等方面均存在一定的缺陷。隨著3Rs（reduction、replacement、refinement）原則的實施，體外替代研究逐漸成為熱點。體外高通量研究與傳統(tǒng)的試驗方法比較，具有相對客觀性，能快速準(zhǔn)確地對受試物的毒性進(jìn)行篩選，節(jié)省人力并保障實驗動物的福利。歐洲替代方法驗證中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM）等目前已建立了一些關(guān)于體外肝毒性的快速檢測方法，并成功應(yīng)用于1 000 多種化合物的快速篩選，準(zhǔn)確性較高。金家金利用高內(nèi)涵篩選分析技術(shù)（high content screening，HCS）針對HepaG2 細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目、DNA 含量、總谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平、ROS 活性氧簇（reactive oxidative species，ROS ） 水平及線粒體膜電位（ mitochondrialmembrane potential，MMP）等指標(biāo)進(jìn)行定量或定性檢測，經(jīng)比較與MTT 比色法結(jié)果基本一致。 線粒體是細(xì)胞能量代謝的主要細(xì)胞器，還能調(diào)控胞內(nèi)各種信號傳導(dǎo)。有研究表明線粒體是許多藥物毒性產(chǎn)生的靶點，藥物的不良反應(yīng)有可能與線粒體受損有直接或間接的關(guān)系。肝臟含有大量線粒體供應(yīng)其代謝所需能量，F(xiàn)DA等機(jī)構(gòu)也明確要求線粒體毒性應(yīng)納入藥物安全性評價中。我司以Hep G2細(xì)胞建立體外模型，檢測化合物對線粒體造成的毒性作用。 我們可進(jìn)行大量化合物的高通量毒性篩選，為客戶高效可靠的化合物篩選服務(wù)。以下是肝毒性化合物Tamoxifen在肝細(xì)胞上作用的部分?jǐn)?shù)據(jù)。 怎么圖片不能放在正文中，也沒看到其他地方放圖片的�。�！抱歉，里面涉及的流程圖與結(jié)果圖不知道咋放進(jìn)來。 主要參考文獻(xiàn)： 1、《甘草查耳酮A對急性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究》 呂紅明 2019年 2、《人源HepaRG 肝細(xì)胞毒性與遺傳毒性高通量篩選方法的初步建立》 文海若等 2017年 |
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