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[交流]
化合物肝臟毒性體外細胞評價
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一、肝臟毒性簡介 肝臟是人類與動物最重要的器官之一，它擔任著代謝與解毒兩大最主要的功能，但它極容易遭受到多種因素的損傷（如：肝炎病毒、藥物毒性、食物發(fā)霉或酒精等）。由這些因素引發(fā)的急性肝損傷（Acute liver failure，ALF）會導致肝細胞大面積壞死或凋亡、肝細胞脂肪變性、炎癥反應以及氧化應激，甚至肝功能損害，它是一種嚴重的疾病并伴有較高的死亡率。因此，采取有效改善肝臟損傷的措施，可能對肝臟疾病的防治起到至關重要作用。 至今，藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）仍然是全球一項嚴重的公共衛(wèi)生問題，而由對乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）誘導的 ALF 占其主導地位。過量的 APAP 在肝臟經(jīng)過一系列的反應，會產(chǎn)生大量活性氧（ROS）引起肝臟嚴重的氧化損傷，最終導致急性肝損傷。因此，抑制過度的炎癥反應和劇烈的氧化應激在防治這兩種肝損傷的致病過程中發(fā)揮著關鍵的作用。 藥物中毒不僅是歐洲國家是主要導致急性肝損傷的因素，在我國也是主要引起急性肝損傷的原因。據(jù)統(tǒng)計，在美國，藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）患者在總急性肝衰竭患者中占有約 57 %的比例，在英國（占 51 %），而在蘇格蘭高達 75 %。在我國，據(jù)全國多中心急性藥物性肝損傷住院病歷調(diào)查分析結果顯示，急性藥物性肝損傷的發(fā)病率呈逐年增加趨勢。 二、肝臟毒性機理 在藥物中毒引起的急性肝損傷中，由對乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）導致的急性肝損傷占其主導地位。在治療劑量下，APAP大部分被二磷酸尿核苷（UDP）葡萄糖醛酸基轉移酶(UGT）和硫酸基轉移酶（SULT）等 II 期代謝酶代謝成無毒化合物，隨尿液排出。只有很小一部分以不變的方式排泄在尿液中。其余約 5-9 %APAP 由細胞色素 P450 酶（CYPs）代謝，主要由 CYP2E1 轉化為高反應性的中間代謝物 N-乙酰苯亞胺基醌（NAPQI）。一般來說，NAPQI 通過與谷胱甘肽（GSH）結合而迅速解毒。然而，當 APAP 過量時會導致 II 期代謝酶飽和，產(chǎn)生過量的 NAPQI 會使谷胱甘肽（glutathione，GSH）消耗殆盡，從而剩下的 NAPQI 則會與細胞膜分子發(fā)生反應，尤其與線粒體蛋白中巰基的共價結合，進而導致線粒體氧化應激和功能障礙，最終引起肝細胞壞死。 急性肝損傷（ALF）的致病機制極為復雜，其中氧化應激、線粒體功能失調(diào)、炎癥反應以及自噬等與其都有著密切的關聯(lián)。 氧化應激是指體內(nèi)的氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡失調(diào)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）過度積累從而導致組織細胞損傷。在 APAP 誘導的急性肝損傷過程中，過多的 APAP 被細胞色素 P450 酶代謝成 NAPQI，它的過度積累進而干擾線粒體電子傳遞鏈復合物 I/II（ETC），導致電子從 ETC 向氧泄漏，形成超氧自由基。超氧化物自由基一旦形成，就會在線粒體中被錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）分解成H2O2和O2，或與內(nèi)源性NO反應形成過氧亞硝基（ONOO−）。然而，H2O2能夠被肝細胞中的 GSH、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、過氧化物還原酶（peroxiredoxin，Prx）等多種抗氧化酶清除。同時，線粒體中形成的 ONOO−也可與 GSH 反應，從而被清除。由于這些過量的自由基會導致 GSH 耗竭，引起 ONOO−的積累，進而使硝基酪氨酸蛋白加合物的形成，最終引發(fā)線粒體 DNA 的損傷和肝毒性。目前，N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）是臨床上治療 APAP 誘導的 ALF 在用的解毒劑，它主要通過補充 GSH 來增強 NAPQI 的解毒作用。但是，該藥物還存在一些缺陷，比如副作用和治療窗口狹窄等問題。一般來說，NAC 的不良反應不會危及生命，但也會引起惡心、嘔吐和初始輸注時的過敏性反應。同時，它的解毒效果，主要是針對 APAP 中毒前 8 小時，之后治療效果明顯開始下降。因此，探究一些有效治療 APAP 肝損傷的藥物和潛在靶標，特別是對于那些在晚期出現(xiàn)的患者，仍然相當需要。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多分子參與 APAP 誘導的氧化應激的調(diào)節(jié)，尤其是 Nrf2，這些分子可能是 APAP 誘導的 ALF 潛在的治療靶點。 在許多方面，炎癥是一種機體改善組織損傷和愈合的生理反應。然而，炎癥過程的嚴重失衡會導致許多疾病的發(fā)生及各種組織損傷。過度的炎癥反應也是引發(fā) ALF 發(fā)生的主要原因之一。首先，多種炎性因子可以直接或間接的方式參與肝組織的損傷。如：腫瘤壞死因子（TNF-α）作為一種關鍵的炎性因子，不僅伴隨各種肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展，而且它的含量高低與肝臟疾病的嚴重程度呈正相關。同時，TNF-α 能直接通過介導 TNF-R1 誘發(fā)肝細胞凋亡，或間接通過誘生多種細胞因子產(chǎn)生，并形成復雜的炎性因子網(wǎng)絡，加劇肝損傷的進展。另外，白介素 1（IL-1）也是一種較強的促炎因子，它可誘導中性粒細胞和血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子，并引發(fā)其他炎性因子的分泌，進而參與炎性反應。其次，IL-6 的生物學活性廣泛，能促進 B 細胞的增殖分化并產(chǎn)生抗體，增多免疫復合物的形成，并引起炎癥反應和靶細胞的損傷�？傊�，這些炎性因子的過多產(chǎn)生會加重肝臟病理組織損傷。大量文獻報道，多種信號分子的激活（包括 NF-κB，MAPK 和 Txnip/NLRP3 炎性小體）參與炎癥反應，在肝損傷中發(fā)揮著十分重要的作用。 自噬是一種分解代謝溶酶體降解過程，最早由 de Duve 和 Wattianux 在 50 年前發(fā)現(xiàn)于肝臟中。目前已發(fā)現(xiàn) 30 多個自噬相關（Atg）基因，它們通過多種信號通路調(diào)控自噬過程。在這個過程中，Beclin-1 結合于分隔膜，主要負責募集Atg 家族蛋白，使 Atg12-Atg5-Atg16 復合物形成，進而促進前自噬泡形成；進一步募集 LC3-II 結合到分隔膜， 加速自噬體外膜的延展擴張，導致Atg12-Atg5-Atg16 復合物的脫落，促進成熟自噬體形成；自噬激活時 LC3-I型迅速轉化為 II 型，并定位于前自噬體和自噬體，在其他 Atg 脫落后，成為自噬體形成的標志性分子。一旦自噬體與溶酶體融合，自噬體內(nèi)的 LC3-II 即被溶酶體中的水解酶降解。另外，AMPK 和 mTOR 激酶也是自噬的關鍵調(diào)控分子。目前，越來越多的證據(jù)支持自噬和細胞死亡之間的交叉作用。在應激反應中，細胞利用自噬作為一種生存機制，在饑餓過程中產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)，消滅入侵的病原體，清除受損的蛋白質(zhì)和細胞器，從而得以生存。在肝臟中，基礎自噬似乎是維持肝臟穩(wěn)態(tài)和細胞存活的關鍵，因為小鼠肝臟中 Atg5 或 Atg7 基因缺失導致細胞死亡增加，嚴重的肝腫大和肝損傷。 據(jù)大量研究表明，在急性肝損傷疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，有多種信號通路直接或間接參與肝損傷的調(diào)節(jié)。其中主要的信號通路有 TLR4-MAPK/-NF-κB，Txnip，NLRP3 炎性小體和 Nrf2 等。 三、肝臟毒性體外評價方法 目前肝細胞毒性仍主要采用傳統(tǒng)的評價技術和手段，在靈敏度和特異性等方面均存在一定的缺陷。隨著3Rs（reduction、replacement、refinement）原則的實施，體外替代研究逐漸成為熱點。體外高通量研究與傳統(tǒng)的試驗方法比較，具有相對客觀性，能快速準確地對受試物的毒性進行篩選，節(jié)省人力并保障實驗動物的福利。歐洲替代方法驗證中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM）等目前已建立了一些關于體外肝毒性的快速檢測方法，并成功應用于1 000 多種化合物的快速篩選，準確性較高。金家金利用高內(nèi)涵篩選分析技術（high content screening，HCS）針對HepaG2 細胞的細胞數(shù)目、DNA 含量、總谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平、ROS 活性氧簇（reactive oxidative species，ROS ） 水平及線粒體膜電位（ mitochondrialmembrane potential，MMP）等指標進行定量或定性檢測，經(jīng)比較與MTT 比色法結果基本一致。 線粒體是細胞能量代謝的主要細胞器，還能調(diào)控胞內(nèi)各種信號傳導。有研究表明線粒體是許多藥物毒性產(chǎn)生的靶點，藥物的不良反應有可能與線粒體受損有直接或間接的關系。肝臟含有大量線粒體供應其代謝所需能量，F(xiàn)DA等機構也明確要求線粒體毒性應納入藥物安全性評價中。我司以Hep G2細胞建立體外模型，檢測化合物對線粒體造成的毒性作用。 我們可進行大量化合物的高通量毒性篩選，為客戶高效可靠的化合物篩選服務。以下是肝毒性化合物Tamoxifen在肝細胞上作用的部分數(shù)據(jù)。 怎么圖片不能放在正文中，也沒看到其他地方放圖片的�。�！抱歉，里面涉及的流程圖與結果圖不知道咋放進來。 主要參考文獻： 1、《甘草查耳酮A對急性肝損傷的保護作用及其機制的研究》 呂紅明 2019年 2、《人源HepaRG 肝細胞毒性與遺傳毒性高通量篩選方法的初步建立》 文海若等 2017年 |
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19樓2020-12-12 11:12:11
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2樓2020-11-20 15:01:38
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my小木蟲6樓
2020-11-21 07:50
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Haibo_12樓
2020-11-21 14:03
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蓉蓉番薯9樓
2020-11-21 14:00
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howtoge13樓
2020-11-21 14:04
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icanspll7樓
2020-11-21 14:00
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likecitywo11樓
2020-11-21 14:01
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yaqianye8樓
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shehuifei14樓
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 成果系統(tǒng)訪問量大，請15分鐘后再嘗試。由此給您造成的不便，敬請諒解。
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xhuama 2026-03-02 | 16/800 |
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本子寫完了，給DS兄弟看了，得了92分
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Doma 2026-03-01 | 10/500 |
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