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XM沐沐新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
求助，TA克隆得到的克隆數(shù)太低 已有1人參與
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| 設(shè)計(jì)了400bp的序列，進(jìn)行TA克隆，轉(zhuǎn)化DH5a感受臺(tái)態(tài)，500ul體系，才得到400左右克隆數(shù)，想要得到1000以上的克隆數(shù)，應(yīng)該怎樣優(yōu)化條件呢？ |
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新蟲(chóng) (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
XM沐沐: 金幣+50, ★★★很有幫助 2020-03-29 22:01:02
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
XM沐沐: 金幣+50, ★★★很有幫助 2020-03-29 22:01:02
| 不清楚你的具體操作。TA克隆涉及到：T-vector, 你的DNA片段（400 bp那個(gè)），DNA連接酶，2×Taq酶。首先你擴(kuò)增的DNA片段回收的濃度如何，保證濃度比較高，如果是用高保真的酶擴(kuò)增的，后面沒(méi)有堿基A，還需要用普通的2×Taq DNA聚合酶末端加A。T-vector理論上用量很少就可以產(chǎn)生大量的克隆，如果你想進(jìn)一步提高克隆量，可以適量加大T-vector的量。T-vector和DNA片段混合后加入DNA連接酶，連接體系直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。這個(gè)鏈接體系量很少，一般就10ul或者20ul。感受態(tài)我們一般自己做的是80ul-100ul，不知道你的500ul 指的感受態(tài)體積還是什么體積？沒(méi)有見(jiàn)過(guò)用這么大體積的感受態(tài)的。這里另外一個(gè)原因就是可能你的感受態(tài)效率不高。綜上，需要考慮的因素有：片段回收濃度如何，連接過(guò)程是否有問(wèn)題，感受態(tài)效果如何。 |
2樓2020-03-29 21:52:38
XM沐沐
新蟲(chóng) (小有名氣)
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3樓2020-03-29 22:00:40
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