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Red同源重組，大腸桿菌EDL933同源重組效率低是什么原因��？
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 萌新最近開始做Red同源重組來敲除大腸桿菌O157(EDL933)中的一個(gè)基因，我用的是pKD4 pKD46 pCP20這三個(gè)質(zhì)粒，從DH5a中提取出來就PCR驗(yàn)證了，證明質(zhì)粒沒有問題，現(xiàn)在已經(jīng)得到了pKD46/O157重組子，下一步就是打靶片段擴(kuò)增，我的打靶片段是選取目的基因上下游50bp同源，然后以pKD4為模板擴(kuò)增含有Kan抗性的打靶片段，L-阿拉伯糖終濃度是30mM，誘導(dǎo)2h，再用10%甘油處理做成電轉(zhuǎn)感受態(tài)，電轉(zhuǎn)條件是2.5kv,5ms。加入1ml LB 30℃孵育2h，之后離心涂布到Kan抗性平板，設(shè)置了陰性對(duì)照（電轉(zhuǎn)水）、陽(yáng)性對(duì)照（電轉(zhuǎn)pKD4），打靶片段還用Dpn 1處理了，但是實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都沒有長(zhǎng)。我懷疑是這樣幾個(gè)原因： 1.電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備活性不夠好 2.打靶片段擴(kuò)增出現(xiàn)錯(cuò)配（我沒有測(cè)序，是PCR產(chǎn)物用Dpn 1酶處理再跑膠切膠回收） 3.是不是同源替換片段太長(zhǎng)了，我打靶片段是1598bp，然后目的基因是699bp，會(huì)不會(huì)是太長(zhǎng)了同源重組難以發(fā)生？ 4.我?guī)熜终f現(xiàn)在第一步就是把陽(yáng)性對(duì)照弄出來，但是陽(yáng)性對(duì)照我看了pKD4和pKD46沒有相同的啟動(dòng)子，應(yīng)該是可以共存的，那就是說明我電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備有問題？ 5.還有個(gè)問題就是我怎么判斷pKD46被誘導(dǎo)表達(dá)了同源重組酶？ 想請(qǐng)教下各位分子大佬，有沒有做這方面的經(jīng)驗(yàn)，能對(duì)小弟我指導(dǎo)下，而且網(wǎng)上查還說大腸桿菌K系列什么的容易敲除，這個(gè)什么系列是怎么查看的呢？ |
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你用DpnI處理后，有沒有再純化一下呢？如果再純化的話，可能會(huì)降低打靶DNA的濃度。如果不純化，可能會(huì)影響電擊。你試試1.5——1.8KV。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
11樓2019-12-03 20:20:01
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寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
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可能是打靶DNA片段濃度太低，導(dǎo)致重組效率低�？梢越档蚿KD 4擴(kuò)增時(shí)的模板濃度，不用DpnI處理，另外，你的電擊電壓太大，導(dǎo)致致死率偏高 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2019-12-03 11:53:27
8樓2019-12-03 17:27:22
9樓2019-12-03 19:50:10
簡(jiǎn)單回復(fù)
2019-12-03 13:06
回復(fù)
2019-12-03 13:20
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2019-12-03 13:31
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biosci7樓
2019-12-03 17:26
回復(fù)
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
j 發(fā)自小木蟲Android客戶端
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