 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 4302 | 回復(fù): 34 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
[交流]
Red同源重組，大腸桿菌EDL933同源重組效率低是什么原因��？
|
|||
 萌新最近開始做Red同源重組來敲除大腸桿菌O157(EDL933)中的一個基因，我用的是pKD4 pKD46 pCP20這三個質(zhì)粒，從DH5a中提取出來就PCR驗證了，證明質(zhì)粒沒有問題，現(xiàn)在已經(jīng)得到了pKD46/O157重組子，下一步就是打靶片段擴增，我的打靶片段是選取目的基因上下游50bp同源，然后以pKD4為模板擴增含有Kan抗性的打靶片段，L-阿拉伯糖終濃度是30mM，誘導(dǎo)2h，再用10%甘油處理做成電轉(zhuǎn)感受態(tài)，電轉(zhuǎn)條件是2.5kv,5ms。加入1ml LB 30℃孵育2h，之后離心涂布到Kan抗性平板，設(shè)置了陰性對照（電轉(zhuǎn)水）、陽性對照（電轉(zhuǎn)pKD4），打靶片段還用Dpn 1處理了，但是實驗組和對照組都沒有長。我懷疑是這樣幾個原因： 1.電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備活性不夠好 2.打靶片段擴增出現(xiàn)錯配（我沒有測序，是PCR產(chǎn)物用Dpn 1酶處理再跑膠切膠回收） 3.是不是同源替換片段太長了，我打靶片段是1598bp，然后目的基因是699bp，會不會是太長了同源重組難以發(fā)生？ 4.我?guī)熜终f現(xiàn)在第一步就是把陽性對照弄出來，但是陽性對照我看了pKD4和pKD46沒有相同的啟動子，應(yīng)該是可以共存的，那就是說明我電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備有問題？ 5.還有個問題就是我怎么判斷pKD46被誘導(dǎo)表達了同源重組酶？ 想請教下各位分子大佬，有沒有做這方面的經(jīng)驗，能對小弟我指導(dǎo)下，而且網(wǎng)上查還說大腸桿菌K系列什么的容易敲除，這個什么系列是怎么查看的呢？ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有293人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 搶金幣啦！回帖就可以得到:
-
上海優(yōu)秀男生誠征結(jié)婚女友符合微信聯(lián)系
+3/817
-
中國科學(xué)院-材料計算小組尋求2026級研究生（包括調(diào)劑生/聯(lián)合培養(yǎng)等）
+5/115
-
CSC國家公派-創(chuàng)新型人才國際培養(yǎng)項目-每年7人-新加坡南洋理工大學(xué)-武漢大學(xué)-校內(nèi)選拔
+1/89
-
誠邀原子層沉積技術(shù)方向博士后
+1/78
-
韓國科學(xué)技術(shù)研究院（KIST）誠招BP項目博士后，待遇優(yōu)厚！
+1/41
-
天津大學(xué) 合成生物與生物制造學(xué)院 招碩士研究生、博士研究生及博士后
+1/33
-
中國石油大學(xué)（北京）國家級大人才團隊博士招生3名：化學(xué)、材料、石油工程：油田化學(xué)
+1/30
-
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所招收1名聯(lián)合培養(yǎng)/客座研究生，碩博皆可
+1/24
-
【招生啟事】大連理工大學(xué)工程力學(xué)系研究生招生
+1/18
-
南京林業(yè)大學(xué)-國家級青年人才團隊 招2026級申請考核制博士（化學(xué)方向）
+1/15
-
求調(diào)劑 初試338 0824船舶 求控制、機械、船舶調(diào)劑
+1/10
-
長江大學(xué)武漢校區(qū)石油工程學(xué)院人才招聘-2026
+1/8
-
211/雙一流-電池/電催化研究方向-化工+化學(xué)+材料化工
+1/7
-
浙江大學(xué)楊林課題組招聘藥物化學(xué)與有機合成方向博士后
+1/6
-
26年博士申請
+1/5
-
溫州大學(xué)化材學(xué)院王娟課題組招生
+1/5
-
大灣區(qū)大學(xué)姚瑤課題組2026屆博士生招生
+1/3
-
2026年北京石油化工學(xué)院環(huán)境學(xué)科-水污染控制工程方向課題組歡迎您
+1/3
-
北京化工大學(xué)Ulrich Schwaneberg/季宇教授課題組2026年招收博士生
+1/3
-
招生材料、化工、環(huán)境工程調(diào)劑
+1/2
8樓2019-12-03 17:27:22
★
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
|
可能是打靶DNA片段濃度太低，導(dǎo)致重組效率低�？梢越档蚿KD 4擴增時的模板濃度，不用DpnI處理，另外，你的電擊電壓太大，導(dǎo)致致死率偏高 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2019-12-03 11:53:27
9樓2019-12-03 19:50:10
10樓2019-12-03 19:52:30
簡單回復(fù)
2019-12-03 13:06
回復(fù)
2019-12-03 13:20
回復(fù)
2019-12-03 13:31
回復(fù)
biosci7樓
2019-12-03 17:26
回復(fù)
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
j 發(fā)自小木蟲Android客戶端
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 334求調(diào)劑 +7 | Trying] 2026-03-06 | 7/350 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 347求調(diào)劑 +3 | 浮云滿足 2026-03-07 | 3/150 |
|
|
[考研] 346分材料求調(diào)劑 +5 | snow_反季節(jié)版 2026-03-07 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 322分 085600求調(diào)劑，有互聯(lián)網(wǎng)+國金及主持省級大創(chuàng)經(jīng)歷 +4 | 熊境喆 2026-03-05 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑學(xué)校 +3 | 一志愿京區(qū)211 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 誠求調(diào)劑，323分 有專利/科研/實習(xí)經(jīng)歷 +6 | 橙子cyx 2026-03-06 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +10 | yang婷 2026-03-02 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 085600材料調(diào)劑 總分330 +6 | 池池丶 2026-03-03 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 282求調(diào)劑 +7 | 夕～日 2026-03-05 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 材料085601一志愿哈工大317 +4 | 壓迫感行 2026-03-04 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 334求調(diào)劑 +3 | Trying] 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +3 | 曼殊2266 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 281電子信息求調(diào)劑 +5 | jhtfeybgj 2026-03-02 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 320材料一志愿西工大專碩英二數(shù)二 有兩年光伏工作經(jīng)驗 +5 | 錘某人 2026-03-04 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境調(diào)劑 +7 | 柒槿levana 2026-03-01 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0857求調(diào)劑 +4 | CDDD1013 2026-03-04 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)306調(diào)劑 +4 | 26要上岸 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +10 | 簡單點0 2026-03-02 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 一志愿中石油（華東）本科齊魯工業(yè)大學(xué) +3 | 石能偉 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +3 | L-xin? 2026-03-01 | 6/300 |
|