 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 35 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 4318 | 回復(fù): 34 | |||
[交流]
Red同源重組，大腸桿菌EDL933同源重組效率低是什么原因啊？
|
|||
 萌新最近開始做Red同源重組來敲除大腸桿菌O157(EDL933)中的一個基因，我用的是pKD4 pKD46 pCP20這三個質(zhì)粒，從DH5a中提取出來就PCR驗(yàn)證了，證明質(zhì)粒沒有問題，現(xiàn)在已經(jīng)得到了pKD46/O157重組子，下一步就是打靶片段擴(kuò)增，我的打靶片段是選取目的基因上下游50bp同源，然后以pKD4為模板擴(kuò)增含有Kan抗性的打靶片段，L-阿拉伯糖終濃度是30mM，誘導(dǎo)2h，再用10%甘油處理做成電轉(zhuǎn)感受態(tài)，電轉(zhuǎn)條件是2.5kv,5ms。加入1ml LB 30℃孵育2h，之后離心涂布到Kan抗性平板，設(shè)置了陰性對照（電轉(zhuǎn)水）、陽性對照（電轉(zhuǎn)pKD4），打靶片段還用Dpn 1處理了，但是實(shí)驗(yàn)組和對照組都沒有長。我懷疑是這樣幾個原因： 1.電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備活性不夠好 2.打靶片段擴(kuò)增出現(xiàn)錯配（我沒有測序，是PCR產(chǎn)物用Dpn 1酶處理再跑膠切膠回收） 3.是不是同源替換片段太長了，我打靶片段是1598bp，然后目的基因是699bp，會不會是太長了同源重組難以發(fā)生？ 4.我?guī)熜终f現(xiàn)在第一步就是把陽性對照弄出來，但是陽性對照我看了pKD4和pKD46沒有相同的啟動子，應(yīng)該是可以共存的，那就是說明我電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備有問題？ 5.還有個問題就是我怎么判斷pKD46被誘導(dǎo)表達(dá)了同源重組酶？ 想請教下各位分子大佬，有沒有做這方面的經(jīng)驗(yàn)，能對小弟我指導(dǎo)下，而且網(wǎng)上查還說大腸桿菌K系列什么的容易敲除，這個什么系列是怎么查看的呢？ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有221人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 搶金幣啦！回帖就可以得到:
-
化學(xué)/材料研究方向湖北省級實(shí)驗(yàn)室招收碩士研究生
+1/149
-
核用高溫高壓水環(huán)境及極端材料服役評價實(shí)驗(yàn)設(shè)備
+1/100
-
燕山大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院Marian Wiercigroch院士團(tuán)隊(duì)招收2026年博士2人，碩士15人
+1/82
-
有機(jī)化- 陸紅健課題組誠招2026級、2027級博士研究生及博士后
+1/80
-
86年歐洲荷比盧老留友征婚國內(nèi)湖南
+1/54
-
arXiv 預(yù)印本求推薦
+2/54
-
香港科技大學(xué)（廣州）科研助理（生物醫(yī)藥領(lǐng)域）招聘啟事
+1/51
-
26調(diào)劑
+1/36
-
瑞典林雪平大學(xué)（linköping university）誠聘 氮化物基無機(jī)材料方向 博士后1名
+1/30
-
坐標(biāo)南京或周邊附近
+1/20
-
金一政教授課題組招聘器件工藝工程師啟事
+1/15
-
深圳大學(xué)機(jī)電與控制工程學(xué)院誠招先進(jìn)制造、激光加工、增材制造、塑性成形等領(lǐng)域博士后
+1/12
-
復(fù)旦大學(xué)集成電路學(xué)院程增光課題組急聘科研助理
+1/7
-
【第三輪招生】澳科大誠招2026年秋季碩士研究生（3月31日下午18:00截止）
+1/6
-
有人帶、成果多、經(jīng)費(fèi)足的課題組招生！��！
+1/2
-
山東大學(xué)高性能傳感器與大數(shù)據(jù)分析團(tuán)隊(duì)誠聘博士后
+1/1
-
CSC-UTT : CNRS 法國國家科學(xué)研究中心/UTT 特魯瓦工程技術(shù)大學(xué) CSC博士phd全獎?wù)猩?/a>
+1/1
-
中科院深圳先進(jìn)院與寧波諾丁漢大學(xué)招收聯(lián)培博士生
+1/1
-
重慶大坪醫(yī)院生信博士招聘
+1/1
-
層流壓差式流量測控產(chǎn)品在大氣 PM2.5 顆粒物采樣分析儀器中的應(yīng)用與優(yōu)勢
+1/1
★
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
|
可能是打靶DNA片段濃度太低，導(dǎo)致重組效率低。可以降低pKD 4擴(kuò)增時的模板濃度，不用DpnI處理，另外，你的電擊電壓太大，導(dǎo)致致死率偏高 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2019-12-03 11:53:27
8樓2019-12-03 17:27:22
10樓2019-12-03 19:52:30
|
你用DpnI處理后，有沒有再純化一下呢？如果再純化的話，可能會降低打靶DNA的濃度。如果不純化，可能會影響電擊。你試試1.5——1.8KV。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
11樓2019-12-03 20:20:01
12樓2019-12-03 22:14:59
29樓2021-04-19 10:59:46
9樓2019-12-03 19:50:10
18樓2020-11-14 20:04:58
31樓2021-06-19 09:43:17
32樓2021-12-16 13:43:11
chenhuanlong
禁蟲 (文學(xué)泰斗)
|
本帖內(nèi)容被屏蔽 |
33樓2021-12-17 14:22:20
34樓2022-01-13 21:49:28
35樓2022-01-13 21:50:33
簡單回復(fù)
2019-12-03 11:15
回復(fù)
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
2019-12-03 13:06
回復(fù)
2019-12-03 13:20
回復(fù)
2019-12-03 13:31
回復(fù)
biosci7樓
2019-12-03 17:26
回復(fù)
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
j 發(fā)自小木蟲Android客戶端
miaojiabing13樓
2019-12-04 08:28
回復(fù)
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
psylhh14樓
2019-12-05 20:12
回復(fù)
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
nono200915樓
2019-12-06 18:01
回復(fù)
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
·
miaojiabing16樓
2019-12-09 11:39
回復(fù)
tzynew17樓
2019-12-09 19:25
回復(fù)
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
shehuifei19樓
2020-11-14 21:19
回復(fù)
likecitywo20樓
2020-11-14 21:20
回復(fù)
gofast11221樓
2020-11-14 21:21
回復(fù)
Haibo_22樓
2020-11-14 21:22
回復(fù)
icanspll23樓
2020-11-14 21:23
回復(fù)
yaqianye24樓
2020-11-14 21:23
回復(fù)
zzhello25樓
2020-11-14 21:24
回復(fù)
howtoge26樓
2020-11-14 21:27
回復(fù)
蓉蓉番薯27樓
2020-11-15 00:09
回復(fù)
LifePursuit28樓
2020-11-15 19:26
回復(fù)
bjdxyxy30樓
2021-04-19 21:06
回復(fù)
寒冬夜寂(金幣+1): 謝謝參與
。 發(fā)自小木蟲Android客戶端
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 寒冬夜寂 的主題更新
| 35 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 環(huán)境調(diào)劑 +3 | 曉看天暮看云 2026-03-09 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 調(diào)劑 +4 | 調(diào)劑的考研學(xué)生 2026-03-09 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工，一志愿廣州985，求調(diào)劑 +14 | qqyyaill 2026-03-05 | 14/700 |
|
|
[考研] 0703化學(xué) 學(xué)碩 理工科均可 不區(qū)分研究方向 總分279求調(diào)劑 +9 | 1一11 2026-03-03 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 086000生物與醫(yī)藥319分求調(diào)劑 +4 | Tolkien 2026-03-07 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +4 | 是Lupa啊 2026-03-08 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)學(xué)院0856材料招收調(diào)劑 +3 | akakk47 2026-03-05 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 269求調(diào)劑 +3 | 朔朔話 2026-03-08 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑學(xué)校 +3 | 一志愿京區(qū)211 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 誠求調(diào)劑，323分 有專利/科研/實(shí)習(xí)經(jīng)歷 +6 | 橙子cyx 2026-03-06 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 282求調(diào)劑 +7 | 夕～日 2026-03-05 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 化工282求調(diào)劑一志愿211 +5 | NA0912 2026-03-05 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 紡織、生物、化學(xué)、材料等專業(yè) +3 | Eember. 2026-03-05 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 泡了個椒 2026-03-04 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +3 | 曼殊2266 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿武漢理工大學(xué)-085602-總分296分-求調(diào)劑 +7 | 紫川葡柚 2026-03-04 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +4 | xuyuan111 2026-03-04 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085600 材料與化工 298 +14 | 小西笑嘻嘻 2026-03-03 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +4 | 是樂渝哇 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)0703求調(diào)劑 學(xué)碩 理/工科均可 總分279 +3 | 1一11 2026-03-03 | 5/250 |
|