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醫(yī)用蠶絲科技新蟲 (初入文壇)
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天然生長(zhǎng)因子“儲(chǔ)藏室”：磺化絲素蛋白實(shí)現(xiàn)FGF-2的高效結(jié)合與活性遞送
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研究背景 細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）通過(guò)其生化與結(jié)構(gòu)特性調(diào)控細(xì)胞行為，并在生長(zhǎng)因子的儲(chǔ)存與遞送中發(fā)揮關(guān)鍵作用。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（FGF-2）作為一種重要的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，在體內(nèi)與ECM中的硫酸化糖胺聚糖（如硫酸乙酰肝素）結(jié)合，影響其穩(wěn)定性、活性和信號(hào)傳導(dǎo)。然而，天然ECM材料存在免疫原性、批次差異等限制。因此，開發(fā)能夠模擬ECM功能的人工材料，實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子的可控釋放與活性保持，成為組織工程中的重要研究方向。 絲素蛋白（SF）因其良好的生物相容性、可降解性和可修飾性，被廣泛用于組織工程。然而，天然SF缺乏特異性細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)因子結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)化學(xué)修飾引入功能性基團(tuán)，如磺酸基團(tuán)，可賦予SF類似ECM的生長(zhǎng)因子結(jié)合與調(diào)控能力。 研究?jī)?nèi)容 本研究通過(guò)重氮偶聯(lián)反應(yīng)，將4-氨基苯磺酸的重氮鹽與SF的酪氨酸殘基偶聯(lián)，成功制備了磺化SF衍生物。天然SF在275nm處有酪氨酸特征吸收峰，而磺化衍生物在325nm處出現(xiàn)偶氮基團(tuán)的特征吸收峰，表明偶聯(lián)反應(yīng)成功。隨著重氮鹽添加量的增加，325nm處的吸光度逐漸升高，表明磺酸基團(tuán)修飾程度增加（圖1A）。通過(guò)紫外-可見光譜法分析偶氮苯基團(tuán)的摻入量，以確定每個(gè)SF分子的磺酸基團(tuán)數(shù)量。根據(jù)紫外吸光度計(jì)算，制備的衍生物每個(gè)SF分子分別含約20、40、55和70個(gè)磺酸基團(tuán)，對(duì)應(yīng)的酪氨酸修飾百分比分別為8%、15%、20% 和 25%（圖1B）。 圖1 磺化絲素蛋白衍生物的合成與表征 通過(guò)測(cè)量天然SF薄膜和磺化SF衍生物薄膜在水蒸氣處理后的接觸角來(lái)確定磺化程度對(duì)親水性的變化（圖2）。天然SF薄膜的接觸角約為71°，而磺化衍生物薄膜的接觸角顯著降低至50°以下。隨著磺化程度的增加，水接觸角逐漸下降，且當(dāng)每個(gè)SF分子含55個(gè)或更多磺酸基團(tuán)時(shí)，接觸角穩(wěn)定在約40°。 圖2 天然SF薄膜和不同磺化SF衍生物薄膜的接觸角變化 為了評(píng)估天然SF及磺化衍生物結(jié)合與釋放FGF-2的能力，研究發(fā)現(xiàn)，在1000ng/mL FGF-2條件下，材料對(duì)FGF-2的結(jié)合量隨磺化程度的增加而顯著提升（圖3A），最高磺化衍生物（每分子含70個(gè)磺酸基團(tuán)）的結(jié)合量（95.2±2.2%）達(dá)到天然SF（48.5±15.1%）的兩倍，且結(jié)合總量與磺酸基團(tuán)數(shù)量呈線性正相關(guān)（圖3B）。在釋放行為方面，所有材料均表現(xiàn)出極高的FGF-2保留能力，超過(guò)99%的結(jié)合量在6天內(nèi)未被釋放（圖3C），并且其釋放速率與磺化程度呈明顯的線性負(fù)相關(guān)，即磺化程度越高，釋放量越低（天然SF釋放0.79%，而最高磺化樣品僅釋放0.20%）（圖3D），且在3天后釋放基本達(dá)到平臺(tái)期。這些結(jié)果表明，磺化修飾能有效且可預(yù)測(cè)地增強(qiáng)SF對(duì)FGF-2的結(jié)合能力并實(shí)現(xiàn)其持續(xù)、可控的滯留。 圖3 天然SF及磺化衍生物結(jié)合與釋放FGF-2的能力 為了探究FGF-2的狀態(tài)（游離態(tài)與結(jié)合態(tài)）對(duì)細(xì)胞行為的影響，本研究首先比較了它們對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）代謝活性的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)至第9天時(shí)，游離態(tài)FGF-2會(huì)導(dǎo)致hMSCs的代謝活性出現(xiàn)顯著且濃度依賴性的下降（100 ng/mL與1000 ng/mL FGF-2分別下降23.5±8.4%與29.2±2.4%）（圖4A, 4B）。與之相對(duì)應(yīng)，當(dāng)FGF-2結(jié)合在最高磺化度的SF衍生物薄膜（70個(gè)磺酸基團(tuán)/分子）上時(shí)，也觀察到了類似的代謝活性抑制效果（下降34.9±6.1%與32.6±4.1%），其下降幅度與游離態(tài)FGF-2無(wú)顯著差異（圖4A, 4B）。該結(jié)果表明，磺化SF材料不僅能有效結(jié)合FGF-2，而且能保留其關(guān)鍵的生物活性，使其能夠以與游離生長(zhǎng)因子相似的方式調(diào)控細(xì)胞的代謝功能。 圖4 游離態(tài)與結(jié)合態(tài)FGF-2對(duì)細(xì)胞代謝活性的影響 在明確了結(jié)合態(tài)與游離態(tài)FGF-2均能抑制細(xì)胞代謝活性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究了不同磺化程度的SF衍生物對(duì)這一效應(yīng)的調(diào)控作用。結(jié)果表明，材料本身的磺化程度是決定hMSCs代謝活性的關(guān)鍵因素：無(wú)論FGF-2存在與否，中等磺化程度（每分子含20-40個(gè)磺酸基團(tuán)）的薄膜均能支持最高的細(xì)胞代謝活性（圖5A, 5B），其中無(wú)FGF-2時(shí)以40個(gè)磺酸基團(tuán)的樣品為最佳，而有FGF-2時(shí)則以20個(gè)磺酸基團(tuán)的樣品為高。相比之下，天然SF薄膜上的細(xì)胞活性始終最低。當(dāng)重點(diǎn)關(guān)注FGF-2的生物活性時(shí)，數(shù)據(jù)顯示，結(jié)合在磺化SF薄膜上的FGF-2在第9天同樣引起了約三分之一的代謝活性顯著下降（圖5C），這一抑制效果與游離FGF-2的趨勢(shì)高度一致，且在所有磺化衍生物上均觀察到該現(xiàn)象，再次證實(shí)了磺化SF能有效維持所結(jié)合生長(zhǎng)因子的生物功能。 圖5 不同磺化程度的SF衍生物對(duì)細(xì)胞代謝活性的調(diào)控作用 為了從信號(hào)通路層面驗(yàn)證FGF-2的活性，本研究進(jìn)一步分析了其對(duì)hMSCs中ERK1/2磷酸化（pERK1/2）水平的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與代謝活性的結(jié)果相呼應(yīng)，游離態(tài)FGF-2（100 ng/mL）能顯著激活MAPK信號(hào)通路，使pERK1/2水平提升51.6±13.6%（圖6A, 6B）。至關(guān)重要的是，當(dāng)FGF-2結(jié)合在最高磺化度的SF薄膜（70個(gè)磺酸基團(tuán)/分子）上時(shí)，同樣能誘導(dǎo)pERK1/2水平出現(xiàn)幅度相似的顯著增強(qiáng)（提升46.1±12.2%與44.1±5.3%）（圖6A, 6B）。該結(jié)果明確證實(shí)，磺化SF不僅能保留FGF-2對(duì)細(xì)胞代謝的調(diào)控功能，更能有效維持其激活下游關(guān)鍵信號(hào)通路的生物效能，從而在分子水平上證明了此遞送系統(tǒng)在保持生長(zhǎng)因子完全生物活性方面的成功。 圖6 游離態(tài)與結(jié)合態(tài)FGF-2對(duì)hMSCs中ERK1/2磷酸化水平的影響 進(jìn)一步評(píng)估了SF磺化程度對(duì)FGF-2誘導(dǎo)pERK1/2水平的影響。結(jié)果顯示，存在一個(gè)明確的磺化程度閾值：只有當(dāng)FGF-2結(jié)合于磺化度不低于40個(gè)磺酸基團(tuán)/分子的SF薄膜時(shí)，才能顯著提升hMSCs的pERK1/2水平（圖7A）。具體而言，含40與70個(gè)磺酸基團(tuán)的衍生物薄膜分別使pERK1/2水平增加了26.2±4.0%與30.5±6.0%（圖7B），而含55個(gè)基團(tuán)的薄膜也呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的上升趨勢(shì)。相比之下，F(xiàn)GF-2結(jié)合在天然SF或低磺化度（20個(gè)基團(tuán)/分子）的衍生物上，則未能引發(fā)pERK1/2水平的顯著變化。此結(jié)果從信號(hào)通路層面精確界定：只有達(dá)到足夠磺化程度（≥40）的SF材料，才能有效維持所結(jié)合FGF-2的完全生物活性，從而確保其對(duì)細(xì)胞行為的正確調(diào)控。 圖7 SF磺化程度對(duì)FGF-2誘導(dǎo)pERK1/2水平的影響 結(jié)論 本研究成功開發(fā)了一系列磺化絲素蛋白衍生物，能夠通過(guò)非共價(jià)作用高效結(jié)合FGF-2，并實(shí)現(xiàn)其持續(xù)保留與可控釋放�；腔疭F材料不僅提高了FGF-2的負(fù)載能力，還保留了其生物活性，表現(xiàn)為對(duì)hMSCs代謝活性的調(diào)控和ERK信號(hào)通路的激活。該研究為開發(fā)ECM仿生材料提供了新策略，尤其在生長(zhǎng)因子遞送系統(tǒng)和組織再生領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用潛力 原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2009.11.006 |
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