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天然生長因子“儲藏室”：磺化絲素蛋白實現(xiàn)FGF-2的高效結合與活性遞送
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研究背景 細胞外基質(zhì)（ECM）通過其生化與結構特性調(diào)控細胞行為，并在生長因子的儲存與遞送中發(fā)揮關鍵作用。成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）作為一種重要的肝素結合生長因子，在體內(nèi)與ECM中的硫酸化糖胺聚糖（如硫酸乙酰肝素）結合，影響其穩(wěn)定性、活性和信號傳導。然而，天然ECM材料存在免疫原性、批次差異等限制。因此，開發(fā)能夠模擬ECM功能的人工材料，實現(xiàn)生長因子的可控釋放與活性保持，成為組織工程中的重要研究方向。 絲素蛋白（SF）因其良好的生物相容性、可降解性和可修飾性，被廣泛用于組織工程。然而，天然SF缺乏特異性細胞黏附和生長因子結合位點。通過化學修飾引入功能性基團，如磺酸基團，可賦予SF類似ECM的生長因子結合與調(diào)控能力。 研究內(nèi)容 本研究通過重氮偶聯(lián)反應，將4-氨基苯磺酸的重氮鹽與SF的酪氨酸殘基偶聯(lián)，成功制備了磺化SF衍生物。天然SF在275nm處有酪氨酸特征吸收峰，而磺化衍生物在325nm處出現(xiàn)偶氮基團的特征吸收峰，表明偶聯(lián)反應成功。隨著重氮鹽添加量的增加，325nm處的吸光度逐漸升高，表明磺酸基團修飾程度增加（圖1A）。通過紫外-可見光譜法分析偶氮苯基團的摻入量，以確定每個SF分子的磺酸基團數(shù)量。根據(jù)紫外吸光度計算，制備的衍生物每個SF分子分別含約20、40、55和70個磺酸基團，對應的酪氨酸修飾百分比分別為8%、15%、20% 和 25%（圖1B）。 圖1 磺化絲素蛋白衍生物的合成與表征 通過測量天然SF薄膜和磺化SF衍生物薄膜在水蒸氣處理后的接觸角來確定磺化程度對親水性的變化（圖2）。天然SF薄膜的接觸角約為71°，而磺化衍生物薄膜的接觸角顯著降低至50°以下。隨著磺化程度的增加，水接觸角逐漸下降，且當每個SF分子含55個或更多磺酸基團時，接觸角穩(wěn)定在約40°。 圖2 天然SF薄膜和不同磺化SF衍生物薄膜的接觸角變化 為了評估天然SF及磺化衍生物結合與釋放FGF-2的能力，研究發(fā)現(xiàn)，在1000ng/mL FGF-2條件下，材料對FGF-2的結合量隨磺化程度的增加而顯著提升（圖3A），最高磺化衍生物（每分子含70個磺酸基團）的結合量（95.2±2.2%）達到天然SF（48.5±15.1%）的兩倍，且結合總量與磺酸基團數(shù)量呈線性正相關（圖3B）。在釋放行為方面，所有材料均表現(xiàn)出極高的FGF-2保留能力，超過99%的結合量在6天內(nèi)未被釋放（圖3C），并且其釋放速率與磺化程度呈明顯的線性負相關，即磺化程度越高，釋放量越低（天然SF釋放0.79%，而最高磺化樣品僅釋放0.20%）（圖3D），且在3天后釋放基本達到平臺期。這些結果表明，磺化修飾能有效且可預測地增強SF對FGF-2的結合能力并實現(xiàn)其持續(xù)、可控的滯留。 圖3 天然SF及磺化衍生物結合與釋放FGF-2的能力 為了探究FGF-2的狀態(tài)（游離態(tài)與結合態(tài)）對細胞行為的影響，本研究首先比較了它們對人骨髓間充質(zhì)干細胞（hMSCs）代謝活性的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)至第9天時，游離態(tài)FGF-2會導致hMSCs的代謝活性出現(xiàn)顯著且濃度依賴性的下降（100 ng/mL與1000 ng/mL FGF-2分別下降23.5±8.4%與29.2±2.4%）（圖4A, 4B）。與之相對應，當FGF-2結合在最高磺化度的SF衍生物薄膜（70個磺酸基團/分子）上時，也觀察到了類似的代謝活性抑制效果（下降34.9±6.1%與32.6±4.1%），其下降幅度與游離態(tài)FGF-2無顯著差異（圖4A, 4B）。該結果表明，磺化SF材料不僅能有效結合FGF-2，而且能保留其關鍵的生物活性，使其能夠以與游離生長因子相似的方式調(diào)控細胞的代謝功能。 圖4 游離態(tài)與結合態(tài)FGF-2對細胞代謝活性的影響 在明確了結合態(tài)與游離態(tài)FGF-2均能抑制細胞代謝活性的基礎上，進一步探究了不同磺化程度的SF衍生物對這一效應的調(diào)控作用。結果表明，材料本身的磺化程度是決定hMSCs代謝活性的關鍵因素：無論FGF-2存在與否，中等磺化程度（每分子含20-40個磺酸基團）的薄膜均能支持最高的細胞代謝活性（圖5A, 5B），其中無FGF-2時以40個磺酸基團的樣品為最佳，而有FGF-2時則以20個磺酸基團的樣品為高。相比之下，天然SF薄膜上的細胞活性始終最低。當重點關注FGF-2的生物活性時，數(shù)據(jù)顯示，結合在磺化SF薄膜上的FGF-2在第9天同樣引起了約三分之一的代謝活性顯著下降（圖5C），這一抑制效果與游離FGF-2的趨勢高度一致，且在所有磺化衍生物上均觀察到該現(xiàn)象，再次證實了磺化SF能有效維持所結合生長因子的生物功能。 圖5 不同磺化程度的SF衍生物對細胞代謝活性的調(diào)控作用 為了從信號通路層面驗證FGF-2的活性，本研究進一步分析了其對hMSCs中ERK1/2磷酸化（pERK1/2）水平的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與代謝活性的結果相呼應，游離態(tài)FGF-2（100 ng/mL）能顯著激活MAPK信號通路，使pERK1/2水平提升51.6±13.6%（圖6A, 6B）。至關重要的是，當FGF-2結合在最高磺化度的SF薄膜（70個磺酸基團/分子）上時，同樣能誘導pERK1/2水平出現(xiàn)幅度相似的顯著增強（提升46.1±12.2%與44.1±5.3%）（圖6A, 6B）。該結果明確證實，磺化SF不僅能保留FGF-2對細胞代謝的調(diào)控功能，更能有效維持其激活下游關鍵信號通路的生物效能，從而在分子水平上證明了此遞送系統(tǒng)在保持生長因子完全生物活性方面的成功。 圖6 游離態(tài)與結合態(tài)FGF-2對hMSCs中ERK1/2磷酸化水平的影響 進一步評估了SF磺化程度對FGF-2誘導pERK1/2水平的影響。結果顯示，存在一個明確的磺化程度閾值：只有當FGF-2結合于磺化度不低于40個磺酸基團/分子的SF薄膜時，才能顯著提升hMSCs的pERK1/2水平（圖7A）。具體而言，含40與70個磺酸基團的衍生物薄膜分別使pERK1/2水平增加了26.2±4.0%與30.5±6.0%（圖7B），而含55個基團的薄膜也呈現(xiàn)出強烈的上升趨勢。相比之下，F(xiàn)GF-2結合在天然SF或低磺化度（20個基團/分子）的衍生物上，則未能引發(fā)pERK1/2水平的顯著變化。此結果從信號通路層面精確界定：只有達到足夠磺化程度（≥40）的SF材料，才能有效維持所結合FGF-2的完全生物活性，從而確保其對細胞行為的正確調(diào)控。 圖7 SF磺化程度對FGF-2誘導pERK1/2水平的影響 結論 本研究成功開發(fā)了一系列磺化絲素蛋白衍生物，能夠通過非共價作用高效結合FGF-2，并實現(xiàn)其持續(xù)保留與可控釋放。磺化SF材料不僅提高了FGF-2的負載能力，還保留了其生物活性，表現(xiàn)為對hMSCs代謝活性的調(diào)控和ERK信號通路的激活。該研究為開發(fā)ECM仿生材料提供了新策略，尤其在生長因子遞送系統(tǒng)和組織再生領域具有廣泛應用潛力 原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2009.11.006 |
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