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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 分子生理 » 免疫熒光染色全流程
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夏末～易科新蟲 (小有名氣)
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免疫熒光染色全流程
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免疫熒光染色從全流程 一. 樣本制作 以冰凍切片為例：首先將組織置于多聚甲醛固定過夜，30%蔗糖脫水后用包埋劑于-20℃冷凍臺上進行冰凍。 將冷凍好的組織塊修平，按照不同的組織調(diào)整好預切厚度，腦組織一般貼片厚度為15-25um。切好的片子室溫晾干后再進行后續(xù)染色處理。 不同的樣本預處理方法不同，關于細胞樣本制備：貼壁細胞樣本基本原理是使細胞生長在合適的固相支持物玻片上，然后進行固定。 二. 熒光染色 根據(jù)一抗是否直接帶熒光標記，將免疫熒光染色分為直接染色或間接染色。 直接染色法是攜帶熒光素的抗體直接與標本內(nèi)的抗原反應，形成抗原—熒光素標記抗體復合物，該法優(yōu)點是較簡單，特異性較高；缺點：應用范圍較窄，敏感性也較低。 實際上在實驗室中，我們最常使用的還是間接染色法，先用特異性抗體與細胞內(nèi)相應抗原結合，再用熒光素標記的二抗與特異性抗體相結合，形成抗原-特異性抗體-標記熒光抗體的復合物。 下面以間接染色法為例展開敘述： 實驗步驟： 1. 復溫復溫：取出制作好的樣本（短期存放-20℃，長期存放-80℃保存），恢復至室溫后，用1xPBS洗滌三次，每次 5 分鐘； 2. 抗原修復：用0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）充分浸泡樣本，微波爐中低火加熱修復，保持微沸狀態(tài)5 min效果最好； 3. 破膜：用 0.5%Triton X-100( 1xPBS配制 )室溫通透20 min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）； 4. 封閉：封閉液蛋白的選擇原則是與一抗蛋白和目標蛋白種屬不同，將非特異性位點結合掉，從而保證后續(xù)熒光染色的特異性。 5. 一抗孵育：用抗體稀釋液將一抗稀釋成目標比例，4℃過夜。 6. 一抗洗脫：第二天將濕盒拿出復溫30 min,用1xPBS洗脫三次，每次5min； 7. 熒光二抗：用抗體稀釋液稀釋熒光二抗，室溫孵育2 h,注意避光; 8. 二抗洗脫：用1xPBS洗脫三次，每次洗脫時間可稍長一些； 9. 封片：用含防淬滅的甘油進行封片，按需可以對細胞核用DAPI進行染色； 10. 拍片：晾干片子后，置于顯微鏡下觀察，獲取熒光圖像。 發(fā)自小木蟲手機客戶端 |
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