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夏末～易科新蟲(chóng) (小有名氣)
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免疫熒光染色全流程
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免疫熒光染色從全流程 一. 樣本制作 以冰凍切片為例：首先將組織置于多聚甲醛固定過(guò)夜，30%蔗糖脫水后用包埋劑于-20℃冷凍臺(tái)上進(jìn)行冰凍。 將冷凍好的組織塊修平，按照不同的組織調(diào)整好預(yù)切厚度，腦組織一般貼片厚度為15-25um。切好的片子室溫晾干后再進(jìn)行后續(xù)染色處理。 不同的樣本預(yù)處理方法不同，關(guān)于細(xì)胞樣本制備：貼壁細(xì)胞樣本基本原理是使細(xì)胞生長(zhǎng)在合適的固相支持物玻片上，然后進(jìn)行固定。 二. 熒光染色 根據(jù)一抗是否直接帶熒光標(biāo)記，將免疫熒光染色分為直接染色或間接染色。 直接染色法是攜帶熒光素的抗體直接與標(biāo)本內(nèi)的抗原反應(yīng)，形成抗原—熒光素標(biāo)記抗體復(fù)合物，該法優(yōu)點(diǎn)是較簡(jiǎn)單，特異性較高；缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍較窄，敏感性也較低。 實(shí)際上在實(shí)驗(yàn)室中，我們最常使用的還是間接染色法，先用特異性抗體與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗與特異性抗體相結(jié)合，形成抗原-特異性抗體-標(biāo)記熒光抗體的復(fù)合物。 下面以間接染色法為例展開(kāi)敘述： 實(shí)驗(yàn)步驟： 1. 復(fù)溫復(fù)溫：取出制作好的樣本（短期存放-20℃，長(zhǎng)期存放-80℃保存），恢復(fù)至室溫后，用1xPBS洗滌三次，每次 5 分鐘； 2. 抗原修復(fù)：用0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）充分浸泡樣本，微波爐中低火加熱修復(fù)，保持微沸狀態(tài)5 min效果最好； 3. 破膜：用 0.5%Triton X-100( 1xPBS配制 )室溫通透20 min（細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟）； 4. 封閉：封閉液蛋白的選擇原則是與一抗蛋白和目標(biāo)蛋白種屬不同，將非特異性位點(diǎn)結(jié)合掉，從而保證后續(xù)熒光染色的特異性。 5. 一抗孵育：用抗體稀釋液將一抗稀釋成目標(biāo)比例，4℃過(guò)夜。 6. 一抗洗脫：第二天將濕盒拿出復(fù)溫30 min,用1xPBS洗脫三次，每次5min； 7. 熒光二抗：用抗體稀釋液稀釋熒光二抗，室溫孵育2 h,注意避光; 8. 二抗洗脫：用1xPBS洗脫三次，每次洗脫時(shí)間可稍長(zhǎng)一些； 9. 封片：用含防淬滅的甘油進(jìn)行封片，按需可以對(duì)細(xì)胞核用DAPI進(jìn)行染色； 10. 拍片：晾干片子后，置于顯微鏡下觀察，獲取熒光圖像。 發(fā)自小木蟲(chóng)手機(jī)客戶(hù)端 |
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