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夏末～易科新蟲 (小有名氣)
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細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
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細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 1?? 實(shí)驗(yàn)原理：Annexin V是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸（PS）有高度親和力。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）外翻到膜表面，而與熒光染料FITC標(biāo)記的Annexin V結(jié)合，可通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè) 由于凋亡晚期或壞死細(xì)胞膜喪失完整性，而4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4,6-Diamidino-2-Phenylindole,DAPI)可與雙鏈DNA特異性結(jié)合并產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，與Annexin V搭配使用，可區(qū)分處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞。 2??實(shí)驗(yàn)步驟： 以下均為貼壁細(xì)胞步驟： 注意避光 使用六孔板鋪板，一般細(xì)胞數(shù)為1×10^5/孔（根據(jù)自身調(diào)整） 1.將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基收集到離心管中（因?yàn)閼乙褐羞�有細(xì)胞） 2.4℃預(yù)冷的PBS洗一次，收集PBS到離心管中（PBS中有細(xì)胞） 3.用500ul無(wú)EDTA的胰酶消化（EDTA會(huì)影響Annexin V與PS結(jié)合），用離心管內(nèi)的培養(yǎng)基終止消化，收集至相應(yīng)離心管中 4.離心后去上清（800rpm , 3min），PBS清洗一次，轉(zhuǎn)移至2mlEP管（1.5ml容易戳到管底） 5.棄上清（可以殘留50 ul上清，避免倒走細(xì)胞），用100ul試劑盒中的Annexin V buffer（10x稀釋成1x）重懸，依次各加入2.5ul Annexin V和 DAPI染料，室溫避光孵育15-20min。除樣本管外，還需設(shè)置空白管、單染管。 后加DAPI染料，因其細(xì)胞毒性大，時(shí)間延長(zhǎng)，PI染色會(huì)增加 空白管：陰性對(duì)照組細(xì)胞，不做任何藥物處理，不加DAPI和Annexin V 染料，目的用于調(diào)節(jié)電壓 單陽(yáng)管：只加DAPI或者Annexin V 染料，目的在于調(diào)節(jié)補(bǔ)償 樣本管：依次加入DAPI和Annexin V 染料，在空白管和單陽(yáng)管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后，獲得所需流式數(shù)據(jù) 6.加入300-400 ul 的1x Annexin V buffer，混勻樣本，注意減少吹打，減少機(jī)械性損傷 7. 立即上機(jī) 3?? 呈現(xiàn)結(jié)果為正常細(xì)胞（Annexin V -/ PI -）、早期凋亡細(xì)胞（Annexin V +/PI -）、晚期凋亡和壞死細(xì)胞（Annexin V +/PI +），一般來(lái)說(shuō)呈現(xiàn)Annexin V - / PI +的細(xì)胞為人為機(jī)械性損傷細(xì)胞 發(fā)自小木蟲手機(jī)客戶端 |
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剛錄用，沒有期刊號(hào)，但是在線可看的論文可以放為代表作嗎
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