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zhiqiang2013新蟲 (初入文壇)
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ELISA試驗(yàn)中不容忽視的細(xì)節(jié)盤點(diǎn)(二)
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洗板 固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測(cè)定的特異性。洗板對(duì)于ELISA測(cè)定來說，是極其關(guān)鍵的一步。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘，甩去板孔中洗液后，大力拍干；及時(shí)更換吸水紙，尤其是拍過酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果。 邊緣效應(yīng) 使用96孔板的ELISA測(cè)定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)” 顯色 顯色一定要控制時(shí)間,一般來說，顯色時(shí)間過短，結(jié)果偏低；顯色時(shí)間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。 比色 比色要注意波長的選擇。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問題。 其次，單波長或雙波長比色選擇的問題。單波長比色即是通常的以對(duì)顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；雙波長雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測(cè)定一次，敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測(cè)定即改變波長至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)。由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí)，最好是使用雙波長比色。 上海酶聯(lián)生物溫馨提示：盡管ELISA測(cè)定操作步驟簡(jiǎn)單，但有可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素卻較多，分布在測(cè)定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚，小伙伴們?cè)谧鰧?shí)驗(yàn)時(shí)多多留意。 |
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