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Abbkine亞科因新蟲(chóng) (初入文壇)
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�；D(zhuǎn)移酶（AAT）活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案
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原理 AAT是一個(gè)多功能蛋白大家族，主要負(fù)責(zé)催化生物體內(nèi)各種�；腿ヵ；磻�(yīng)，在基因表達(dá)、代謝和信號(hào)傳導(dǎo)中具有重要作用。CheKine™ 酰基轉(zhuǎn)移酶（AAT）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）可檢測(cè)生物體內(nèi)AAT活性，其原理是：AAT催化乙酰CoA轉(zhuǎn)移乙酰基到丁醇，同時(shí)還原DTNB生成TNB；TNB在412 nm有特征吸收峰，測(cè)定412 nm吸光度增加速率，來(lái)計(jì)算AAT活性。 自備耗材 ·酶標(biāo)儀或可見(jiàn)分光光度計(jì)（能測(cè)412 nm處的吸光度） ·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭 ·恒溫箱、制冰機(jī)、低溫離心機(jī) ·無(wú)水乙醇 ·勻漿器（如果是組織樣本） 試劑準(zhǔn)備 Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。 Receptor：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。 Substrate：臨用前96 T加入21.6 mL Receptor，48 T加入10.8 mL Receptor，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存一周，禁止反復(fù)凍融。 Chromogen：臨用前96 T加入無(wú)水乙醇1.2 mL，48 T加入無(wú)水乙醇0.6 mL，充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存兩周。 工作液的配制：每孔配制190 µL工作液：吸取180 µL溶解后的Substrate，10 µL Chromogen。工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，根據(jù)需要測(cè)定的樣本數(shù)按比例配制。 樣本制備 注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。處理好的樣本須當(dāng)天檢測(cè)。 1. 動(dòng)物組織：稱取約0.1 g樣本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴勻漿，8,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。 2. 植物組織：稱取約0.1 g樣本，加入1 mL Extraction Buffer搗碎，冰浴超聲波破碎5 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s，重復(fù)30次），然后8,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。 3. 細(xì)胞或細(xì)菌：收集500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗，離心后棄上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超聲波破碎5 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s，重復(fù)30次），然后8,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。 4. 血清（漿）等液體樣本：直接測(cè)定。 注意：對(duì)于脂肪含量較高的動(dòng)物組織，離心后移除上層脂肪，再取上清液。如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。 實(shí)驗(yàn)步驟 1. 酶標(biāo)儀或可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。 2. 恒溫箱預(yù)熱到37℃，工作液置于恒溫箱中預(yù)熱15 min。 3. 在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10 μL樣本或Extraction Buffer，190 μL工作液，迅速混勻，37℃孵育2 min，測(cè)定412 nm處吸光值。樣本的吸光值為A測(cè)，Extraction Buffer的吸光值為A空，計(jì)算ΔA測(cè)=A測(cè)-A空。 注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.001可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA大于1.5，樣本可用Extraction Buffer進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。 結(jié)果計(jì)算 注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。 A. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式 1. 按照蛋白濃度計(jì)算 活性單位定義：每mg蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。 AAT酶活(U/mg prot)=(ΔA測(cè)÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T×n=1,470.6×ΔA測(cè)÷Cpr×n 2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算 活性單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。 AAT酶活(U/g 鮮重)=(ΔA測(cè)÷ε÷d×V反總×109)÷(W×V樣÷V樣總)÷T×n=1,470.6×ΔA測(cè)÷W×n 3. 按細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算 活性單位定義：每104個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。 AAT酶活(U/104)=(ΔA測(cè)÷ε÷d×V反總×109)÷(細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T×n=1,470.6×ΔA測(cè)÷500×n=2.9412×ΔA測(cè)×n 4. 按液體體積計(jì)算 活性單位定義：每mL樣本每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。 AAT酶活(U/mL)=(ΔA測(cè)÷ε÷d×V反總×109)÷V樣÷T×n=1,470.6×ΔA測(cè)×n ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×103 L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，L，200 μL=2×10-4 L；109：1 mol=1×109 nmol；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；V樣：加入上清液體積，0.01 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；n：樣本稀釋倍數(shù)；W：樣品質(zhì)量，g；V樣總：提取液體積，1 mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。 B. 使用微量玻璃比色皿測(cè)定的計(jì)算公式 將上述計(jì)算公式中的光徑d: 0.5 cm調(diào)整為d: 1 cm進(jìn)行計(jì)算即可。 結(jié)果展示 Figure 1. 小鼠肝臟、水稻葉子和玉米種子中的AAT活性。 |
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