 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 773 | 回復: 0 | |||
[交流]
�；D移酶（AAT）活性檢測試劑盒實驗解決方案
|
|
原理 AAT是一個多功能蛋白大家族，主要負責催化生物體內(nèi)各種酰基化和去酰基化反應，在基因表達、代謝和信號傳導中具有重要作用。CheKine™ 酰基轉移酶（AAT）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測生物體內(nèi)AAT活性，其原理是：AAT催化乙酰CoA轉移乙�；蕉〈�，同時還原DTNB生成TNB；TNB在412 nm有特征吸收峰，測定412 nm吸光度增加速率，來計算AAT活性。 自備耗材 ·酶標儀或可見分光光度計（能測412 nm處的吸光度） ·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭 ·恒溫箱、制冰機、低溫離心機 ·無水乙醇 ·勻漿器（如果是組織樣本） 試劑準備 Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。 Receptor：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。 Substrate：臨用前96 T加入21.6 mL Receptor，48 T加入10.8 mL Receptor，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存一周，禁止反復凍融。 Chromogen：臨用前96 T加入無水乙醇1.2 mL，48 T加入無水乙醇0.6 mL，充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存兩周。 工作液的配制：每孔配制190 µL工作液：吸取180 µL溶解后的Substrate，10 µL Chromogen。工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，根據(jù)需要測定的樣本數(shù)按比例配制。 樣本制備 注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。處理好的樣本須當天檢測。 1. 動物組織：稱取約0.1 g樣本，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴勻漿，8,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。 2. 植物組織：稱取約0.1 g樣本，加入1 mL Extraction Buffer搗碎，冰浴超聲波破碎5 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s，重復30次），然后8,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。 3. 細胞或細菌：收集500萬細胞或細菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗，離心后棄上清，加入1 mL Extraction Buffer，冰浴超聲波破碎5 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s，重復30次），然后8,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。 4. 血清（漿）等液體樣本：直接測定。 注意：對于脂肪含量較高的動物組織，離心后移除上層脂肪，再取上清液。如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。 實驗步驟 1. 酶標儀或可見分光光度計預熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長到412 nm，可見分光光度計用去離子水調(diào)零。 2. 恒溫箱預熱到37℃，工作液置于恒溫箱中預熱15 min。 3. 在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10 μL樣本或Extraction Buffer，190 μL工作液，迅速混勻，37℃孵育2 min，測定412 nm處吸光值。樣本的吸光值為A測，Extraction Buffer的吸光值為A空，計算ΔA測=A測-A空。 注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA小于0.001可適當加大樣本量。如果ΔA大于1.5，樣本可用Extraction Buffer進一步稀釋，計算結果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。 結果計算 注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎�，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。 A. 使用96孔板測定的計算公式 1. 按照蛋白濃度計算 活性單位定義：每mg蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB的酶量為1個酶活單位。 AAT酶活(U/mg prot)=(ΔA測÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T×n=1,470.6×ΔA測÷Cpr×n 2. 按照樣本質(zhì)量計算 活性單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB的酶量為1個酶活單位。 AAT酶活(U/g 鮮重)=(ΔA測÷ε÷d×V反總×109)÷(W×V樣÷V樣總)÷T×n=1,470.6×ΔA測÷W×n 3. 按細胞或細菌數(shù)量計算 活性單位定義：每104個細胞或細菌每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB的酶量為1個酶活單位。 AAT酶活(U/104)=(ΔA測÷ε÷d×V反總×109)÷(細胞或細菌數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T×n=1,470.6×ΔA測÷500×n=2.9412×ΔA測×n 4. 按液體體積計算 活性單位定義：每mL樣本每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB的酶量為1個酶活單位。 AAT酶活(U/mL)=(ΔA測÷ε÷d×V反總×109)÷V樣÷T×n=1,470.6×ΔA測×n ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×103 L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應體系總體積，L，200 μL=2×10-4 L；109：1 mol=1×109 nmol；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；V樣：加入上清液體積，0.01 mL；T：反應時間，2 min；n：樣本稀釋倍數(shù)；W：樣品質(zhì)量，g；V樣總：提取液體積，1 mL；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。 B. 使用微量玻璃比色皿測定的計算公式 將上述計算公式中的光徑d: 0.5 cm調(diào)整為d: 1 cm進行計算即可。 結果展示 Figure 1. 小鼠肝臟、水稻葉子和玉米種子中的AAT活性。 |
回復此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有177人回復
-
蛋白質(zhì)檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 Abbkine亞科因 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +3 | ounce. 2026-03-05 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 324求調(diào)劑 +5 | wxz2 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考博] 2026年博士名額撿漏 +4 | 科研ya 2026-03-04 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +3 | 馳光絕景 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +4 | 曼殊2266 2026-03-05 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 313求調(diào)劑 +3 | 水流年lc 2026-02-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 274環(huán)境工程求調(diào)劑 +6 | 扶柳盈江 2026-03-05 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +7 | 曼殊2266 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境調(diào)劑 +7 | 柒槿levana 2026-03-01 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料復試調(diào)劑 +7 | 學材料的點 2026-03-01 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 070300調(diào)劑一志愿南京大學化學專業(yè)，初試273分，有論文有專利有競賽，求調(diào)劑B區(qū)211 +3 | 82206202 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 武理材料工程302調(diào)劑 +3 | Doleres 2026-03-03 | 6/300 |
|
|
|
[論文投稿]
EST拒稿重投
 5+3
|
15102603076 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 化工專碩調(diào)劑 +4 | 利好利好. 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[碩博家園] 2025屆雙非化工碩士畢業(yè)，申博 +4 | 更多的是 2026-02-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿華中科技大學，化學專業(yè)344分，求調(diào)劑 +6 | 邢xing1 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +6 | wyyyqx 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[論文投稿]
通訊作者寫誰，問題是你意想不到的問題
15+3
|
阿爾法啊 2026-03-01 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 285求調(diào)劑 +9 | 滿頭大汗的學生 2026-02-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 哈工大計算機劉劼團隊招生 +4 | hit_aiot 2026-03-01 | 6/300 |
|