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kinpri新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助，通過CRISPR在內(nèi)源性基因后邊插入GFP 已有1人參與
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目的是想內(nèi)源性基因終止密碼子前插入GFP，讓GFP和目的基因一起表達 我使用的gRNA質(zhì)粒是lentiCRISPR-v2，設(shè)計了兩個gRNA，把兩個gRNA中間的序列完全敲除，PAM序列在切除的這一段序列中，所以沒有做donor的點突變 donor質(zhì)粒是pEASY blunt simple cloning kit，選取了兩個gRNA左右側(cè)各800bpDNA序列，兩端DNA序列中間是P2A-GFP，通過重疊PCR將三個片段P到一起后直接和線性化的載體相連 構(gòu)好質(zhì)粒后用lipo3000轉(zhuǎn)染 現(xiàn)在的情況是我?guī)熃阋苍谧鲞@個實驗，但是和我用的細胞不一樣，她的情況是gRNA位點發(fā)生了突變，但沒用donor做模板進行修復(fù) 我用的是胚胎干，但一直沒轉(zhuǎn)進去，所以現(xiàn)在想先換個細胞試下效果，看能不能成功插入GFP，如果能成功再用胚胎干做 有沒有大佬知道問題出在哪里 pEASY.png |
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2樓2024-06-21 15:06:58
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