 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 2 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 942 | 回復(fù): 1 | |||
| 【懸賞金幣】回答本帖問題，作者kinpri將贈(zèng)送您 23 個(gè)金幣 | |||
kinpri新蟲 (初入文壇)
|
[求助]
求助，通過CRISPR在內(nèi)源性基因后邊插入GFP 已有1人參與
|
||
|
目的是想內(nèi)源性基因終止密碼子前插入GFP，讓GFP和目的基因一起表達(dá) 我使用的gRNA質(zhì)粒是lentiCRISPR-v2，設(shè)計(jì)了兩個(gè)gRNA，把兩個(gè)gRNA中間的序列完全敲除，PAM序列在切除的這一段序列中，所以沒有做donor的點(diǎn)突變 donor質(zhì)粒是pEASY blunt simple cloning kit，選取了兩個(gè)gRNA左右側(cè)各800bpDNA序列，兩端DNA序列中間是P2A-GFP，通過重疊PCR將三個(gè)片段P到一起后直接和線性化的載體相連 構(gòu)好質(zhì)粒后用lipo3000轉(zhuǎn)染 現(xiàn)在的情況是我?guī)熃阋苍谧鲞@個(gè)實(shí)驗(yàn)，但是和我用的細(xì)胞不一樣，她的情況是gRNA位點(diǎn)發(fā)生了突變，但沒用donor做模板進(jìn)行修復(fù) 我用的是胚胎干，但一直沒轉(zhuǎn)進(jìn)去，所以現(xiàn)在想先換個(gè)細(xì)胞試下效果，看能不能成功插入GFP，如果能成功再用胚胎干做 有沒有大佬知道問題出在哪里 pEASY.png |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
推薦一些20種氨基酸檢測的實(shí)際應(yīng)用案例
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有115人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
fjgcwrn
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 16
- 帖子: 12
- 在線: 3.8小時(shí)
- 蟲號(hào): 3642139
- 注冊(cè): 2015-01-13
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
|
不建議雙點(diǎn)進(jìn)行切割，如果你的P2A-GFP插入位置選在最后一個(gè)外顯子的后面，雙sgRNA切割掉的內(nèi)含子區(qū)域?yàn)閜re-mRNA進(jìn)行內(nèi)含子切割的識(shí)別序列可能導(dǎo)致最后一個(gè)外顯子無法正確形成mRNA。當(dāng)然這是成功Donor進(jìn)去之后考慮的事情。 現(xiàn)在首要的目的先去檢測你兩個(gè)sgRNA是否發(fā)生一定概率的切割，即使切開，Donor依然存在概率。當(dāng)然你沒切開，肯定Donor不進(jìn)去。 |
2樓2024-06-21 15:06:58
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 kinpri 的主題更新
| 2 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 接收調(diào)劑 +15 | 津萌津萌 2026-03-02 | 23/1150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 304分材料專碩求調(diào)劑 +3 | qiuzhigril 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703 總分319求調(diào)劑 +4 | Xinyuu 2026-03-02 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +4 | Afy123456 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)306調(diào)劑 +4 | 26要上岸 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 理學(xué)，工學(xué)，農(nóng)學(xué)調(diào)劑，少走彎路，這里歡迎您！ +8 | likeihood 2026-03-02 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +9 | 鹿沫笙 2026-03-02 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿華中科技大學(xué)，化學(xué)專業(yè)344分，求調(diào)劑 +6 | 邢xing1 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿中科大能動(dòng)297求調(diào)劑，本科川大 +3 | 邵11 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)材料與化工281求調(diào)劑，有科研和獲獎(jiǎng)經(jīng)歷 +6 | wsxw 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 26考研報(bào)考西工大材料308分求調(diào)劑 +4 | weizhong123 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[考博] 26申博 +4 | north， 2026-02-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0857調(diào)劑 +6 | 一ll半 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +7 | axyz3 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 材料085601調(diào)劑 +5 | 多多子. 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料類求調(diào)劑 +11 | wana_kiko 2026-02-28 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 322求調(diào)劑 +3 | 熊境喆 2026-03-01 | 3/150 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)]
 本子寫完了，給DS兄弟看了，得了92分
+3
|
Doma 2026-03-01 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0856材料求調(diào)劑 +4 | 麻辣魷魚 2026-02-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +6 | 亭亭亭01 2026-03-01 | 6/300 |
|