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科研顧問(wèn)_Gu新蟲(chóng) (小有名氣)
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干貨分享｜脾細(xì)胞的分離、凍存和復(fù)蘇 已有2人參與
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脾細(xì)胞是ELISpot和FluoroSpot測(cè)定中使用最多的細(xì)胞，至少對(duì)小鼠和大鼠樣本而言是如此。脾細(xì)胞可以很容易地從脾臟中分離出來(lái)，而不需要Ficoll分離。細(xì)胞可以在分離后直接使用，也可以冷凍保存，并在以后批量使用。 下面是編譯自https://www.mabtech.com/knowledg ... thawing-splenocytes的關(guān)于如何最好地（i）分離、（ii）凍存和（iii）復(fù)蘇脾細(xì)胞的詳細(xì)指南。 脾細(xì)胞的分離 材料 細(xì)胞過(guò)濾器，70µm尼龍，無(wú)菌 無(wú)菌剪刀和鑷子或鑷子 無(wú)菌培養(yǎng)皿 巴氏移液管，無(wú)菌 無(wú)菌注射器，3毫升或5毫升（無(wú)針） 聚丙烯離心管：15ml，無(wú)菌 培養(yǎng)基：RPMI1640，已添加100µg/mL青霉素+100µg/mL鏈霉素 步驟 1.把脾臟倒進(jìn)培養(yǎng)皿里。如有需要，使用剪刀、鑷子或鑷子去除多余的脂肪和組織。 2.將細(xì)胞濾網(wǎng)放入新的培養(yǎng)皿中，將脾臟轉(zhuǎn)移到濾網(wǎng)中。加入5毫升培養(yǎng)基。 3.使用注射器的扁平柱塞端，通過(guò)細(xì)胞過(guò)濾器將脾臟勻漿到培養(yǎng)皿中。 4.用5ml培養(yǎng)基將細(xì)胞濾網(wǎng)中的細(xì)胞沖洗到培養(yǎng)皿中。 5.將脾細(xì)胞從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到15ml離心管中。 6.將試管靜置一分鐘，讓大塊沉淀物沉淀或使用無(wú)菌巴斯德移液管去除團(tuán)塊和粘連體。將脾細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到新的15ml離心管中，再加入培養(yǎng)基重懸。 7.以300xg離心10分鐘。 8.去除上清并將細(xì)胞沉淀重懸于15ml培養(yǎng)基中。 9.記下體積，取一小份進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。 10.以300xg離心10分鐘。（提示：在此步驟中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)） 11.如果要立即使用細(xì)胞，則去除上清后，并通過(guò)輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞沉淀重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基中，就可以用于基于細(xì)胞的免疫測(cè)定，如ELISpot、FluoroSpot和流式細(xì)胞術(shù)。如果需要凍存細(xì)胞，則進(jìn)入下一步。 脾細(xì)胞的凍存 材料 冷凍培養(yǎng)基：RPMI1640（含2mM L-谷氨酰胺），+20%FCS和10%DMSO。如果細(xì)胞使用的是無(wú)血清培養(yǎng)基，請(qǐng)使用 7%DMSO 冷凍容器，例如“CoolCell”或“Mr.結(jié)霜” 聚丙烯離心管：50mL和/或15mL，無(wú)菌 自動(dòng)移液器和無(wú)菌吸頭 凍存管，例如1.8mL -80℃冰柜 -150℃冰柜或液氮罐 步驟 1.接著上一節(jié)第11步，去上清，在冷凍培養(yǎng)基中將細(xì)胞稀釋至濃度為5-2500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml。如果您使用的是無(wú)血清冷凍培養(yǎng)基，則使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml。 2.分裝，例如，每支凍存管中分1 mL，并將凍存管轉(zhuǎn)移至冷凍容器中。確保通過(guò)不斷重懸使細(xì)胞保持懸浮狀態(tài)。 3.迅速將冷凍容器置于-80℃冰箱中，并儲(chǔ)存至少4小時(shí)，最多1周。 4.將凍存管從冷凍容器中轉(zhuǎn)移至-150℃冰箱或液氮罐中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 脾細(xì)胞的復(fù)蘇 材料 細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI 1640（含2mML-谷氨酰胺）+ 10%FCS、10mM HEPES和100µg/mL青霉素 + 100µg/mL鏈霉素 37℃水浴 聚丙烯離心管：50mL和/或15mL，無(wú)菌 移液器和移液器男孩 自動(dòng)移液器和無(wú)菌吸頭 室溫離心機(jī) CO2培養(yǎng)箱 (37°C) 步驟 1.將凍存管從冷凍庫(kù)中迅速轉(zhuǎn)移至37℃水浴中，解凍細(xì)胞，直至僅剩余少量冰晶。 2.向凍存管中緩慢加入0.5-1mL細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，并從凍存管中轉(zhuǎn)移至15mL 試管中。用1mL 細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗凍存管，并將剩余細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)移至 15mL試管中。最后再向試管中加入更多的細(xì)胞培養(yǎng)基。 3.以300xg離心10min。 4.去上清，輕拍試管，使沉淀物不那么致密。通過(guò)緩慢上下吸液，將細(xì)胞重懸于1mL 細(xì)胞培養(yǎng)基中。加入細(xì)胞培養(yǎng)基至總體積為15mL。 5.以300xg 離心10min。 6.去上清，將沉淀重懸于1mL 細(xì)胞培養(yǎng)基中。添加更多的細(xì)胞培養(yǎng)基（例如，5mL，取決于預(yù)期的細(xì)胞數(shù)量和所需的細(xì)胞濃度）。 7.將細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中1小時(shí)。保持瓶蓋略微打開(kāi)。（凍存培養(yǎng)基含有對(duì)細(xì)胞有毒性的DMSO，如果你要復(fù)蘇多管，建議少拿幾管操作，需盡快從第1步進(jìn)到第2步）。 8.孵育后，重懸細(xì)胞，并使聚集的細(xì)胞碎片或團(tuán)塊沉淀（大約需要 min）。然后小心地將沒(méi)有碎片的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的15mL試管中。 9.計(jì)數(shù)細(xì)胞并測(cè)定細(xì)胞活力�？墒褂米詣�(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或使用顯微鏡的臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果細(xì)胞濃度低于所需濃度，再次離心細(xì)胞，重懸并稀釋至正確體積。 |
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鉛華于鉛
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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請(qǐng)問(wèn)分離之后的細(xì)胞重懸到培養(yǎng)基中能放多久呢 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
2樓2024-07-11 11:26:44
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
nono2009: 金幣-100, 屏蔽內(nèi)容, 違規(guī)存檔, 違規(guī)信息 2024-07-14 19:39:20
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
nono2009: 金幣-100, 屏蔽內(nèi)容, 違規(guī)存檔, 違規(guī)信息 2024-07-14 19:39:20
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3樓2024-07-14 19:07:55
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