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科研顧問_Gu新蟲 (小有名氣)
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干貨分享｜脾細胞的分離、凍存和復(fù)蘇 已有2人參與
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脾細胞是ELISpot和FluoroSpot測定中使用最多的細胞，至少對小鼠和大鼠樣本而言是如此。脾細胞可以很容易地從脾臟中分離出來，而不需要Ficoll分離。細胞可以在分離后直接使用，也可以冷凍保存，并在以后批量使用。 下面是編譯自https://www.mabtech.com/knowledg ... thawing-splenocytes的關(guān)于如何最好地（i）分離、（ii）凍存和（iii）復(fù)蘇脾細胞的詳細指南。 脾細胞的分離 材料 細胞過濾器，70µm尼龍，無菌 無菌剪刀和鑷子或鑷子 無菌培養(yǎng)皿 巴氏移液管，無菌 無菌注射器，3毫升或5毫升（無針） 聚丙烯離心管：15ml，無菌 培養(yǎng)基：RPMI1640，已添加100µg/mL青霉素+100µg/mL鏈霉素 步驟 1.把脾臟倒進培養(yǎng)皿里。如有需要，使用剪刀、鑷子或鑷子去除多余的脂肪和組織。 2.將細胞濾網(wǎng)放入新的培養(yǎng)皿中，將脾臟轉(zhuǎn)移到濾網(wǎng)中。加入5毫升培養(yǎng)基。 3.使用注射器的扁平柱塞端，通過細胞過濾器將脾臟勻漿到培養(yǎng)皿中。 4.用5ml培養(yǎng)基將細胞濾網(wǎng)中的細胞沖洗到培養(yǎng)皿中。 5.將脾細胞從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到15ml離心管中。 6.將試管靜置一分鐘，讓大塊沉淀物沉淀或使用無菌巴斯德移液管去除團塊和粘連體。將脾細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到新的15ml離心管中，再加入培養(yǎng)基重懸。 7.以300xg離心10分鐘。 8.去除上清并將細胞沉淀重懸于15ml培養(yǎng)基中。 9.記下體積，取一小份進行細胞計數(shù)。 10.以300xg離心10分鐘。（提示：在此步驟中對細胞進行計數(shù)） 11.如果要立即使用細胞，則去除上清后，并通過輕輕吹打?qū)⒓毎恋碇貞矣诩毎囵B(yǎng)基中，就可以用于基于細胞的免疫測定，如ELISpot、FluoroSpot和流式細胞術(shù)。如果需要凍存細胞，則進入下一步。 脾細胞的凍存 材料 冷凍培養(yǎng)基：RPMI1640（含2mM L-谷氨酰胺），+20%FCS和10%DMSO。如果細胞使用的是無血清培養(yǎng)基，請使用 7%DMSO 冷凍容器，例如“CoolCell”或“Mr.結(jié)霜” 聚丙烯離心管：50mL和/或15mL，無菌 自動移液器和無菌吸頭 凍存管，例如1.8mL -80℃冰柜 -150℃冰柜或液氮罐 步驟 1.接著上一節(jié)第11步，去上清，在冷凍培養(yǎng)基中將細胞稀釋至濃度為5-2500萬個細胞/ml。如果您使用的是無血清冷凍培養(yǎng)基，則使細胞濃度達到100萬個細胞/ml。 2.分裝，例如，每支凍存管中分1 mL，并將凍存管轉(zhuǎn)移至冷凍容器中。確保通過不斷重懸使細胞保持懸浮狀態(tài)。 3.迅速將冷凍容器置于-80℃冰箱中，并儲存至少4小時，最多1周。 4.將凍存管從冷凍容器中轉(zhuǎn)移至-150℃冰箱或液氮罐中長期儲存。 脾細胞的復(fù)蘇 材料 細胞培養(yǎng)基：RPMI 1640（含2mML-谷氨酰胺）+ 10%FCS、10mM HEPES和100µg/mL青霉素 + 100µg/mL鏈霉素 37℃水浴 聚丙烯離心管：50mL和/或15mL，無菌 移液器和移液器男孩 自動移液器和無菌吸頭 室溫離心機 CO2培養(yǎng)箱 (37°C) 步驟 1.將凍存管從冷凍庫中迅速轉(zhuǎn)移至37℃水浴中，解凍細胞，直至僅剩余少量冰晶。 2.向凍存管中緩慢加入0.5-1mL細胞培養(yǎng)基，重懸細胞，并從凍存管中轉(zhuǎn)移至15mL 試管中。用1mL 細胞培養(yǎng)基沖洗凍存管，并將剩余細胞繼續(xù)轉(zhuǎn)移至 15mL試管中。最后再向試管中加入更多的細胞培養(yǎng)基。 3.以300xg離心10min。 4.去上清，輕拍試管，使沉淀物不那么致密。通過緩慢上下吸液，將細胞重懸于1mL 細胞培養(yǎng)基中。加入細胞培養(yǎng)基至總體積為15mL。 5.以300xg 離心10min。 6.去上清，將沉淀重懸于1mL 細胞培養(yǎng)基中。添加更多的細胞培養(yǎng)基（例如，5mL，取決于預(yù)期的細胞數(shù)量和所需的細胞濃度）。 7.將細胞置于CO2培養(yǎng)箱中1小時。保持瓶蓋略微打開。（凍存培養(yǎng)基含有對細胞有毒性的DMSO，如果你要復(fù)蘇多管，建議少拿幾管操作，需盡快從第1步進到第2步）。 8.孵育后，重懸細胞，并使聚集的細胞碎片或團塊沉淀（大約需要 min）。然后小心地將沒有碎片的細胞懸液轉(zhuǎn)移到新的15mL試管中。 9.計數(shù)細胞并測定細胞活力�？墒褂米詣蛹毎嫈�(shù)器或使用顯微鏡的臺盼藍染色進行計數(shù)。如果細胞濃度低于所需濃度，再次離心細胞，重懸并稀釋至正確體積。 |
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鉛華于鉛
新蟲 (初入文壇)
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2樓2024-07-11 11:26:44
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nono2009: 金幣-100, 屏蔽內(nèi)容, 違規(guī)存檔, 違規(guī)信息 2024-07-14 19:39:20
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3樓2024-07-14 19:07:55
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