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科研實(shí)驗(yàn)_研實(shí)新蟲(chóng) (小有名氣)
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干貨分享 | 活性氧ROS的流式檢測(cè)
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活性氧（ROS）的流式檢測(cè)通常是通過(guò)使用熒光探針如DCFH-DA來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化。以下是該檢測(cè)方法的一些關(guān)鍵步驟和原理： 0 1 選擇熒光探針 常用的熒光染料是DCFH-DA，它能夠進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解成DCFH。DCFH隨后可以被細(xì)胞內(nèi)的活性氧氧化，生成發(fā)熒光的DCF。 0 2 DCFH-DA 是一種用于檢測(cè)活性氧ROS的熒光探針，全稱(chēng)為2,7-二氯熒光素二乙酸酯。其工作原理為：DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，但可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，一旦進(jìn)入細(xì)胞，它會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH，由于DCFH無(wú)法穿過(guò)細(xì)胞膜，因此熒光探針會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積聚。細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠氧化無(wú)熒光的DCFH，生成有熒光的DCF，且熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比。通過(guò)熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備，在最大激發(fā)波長(zhǎng)480nm和最大發(fā)射波長(zhǎng)525nm下檢測(cè)熒光信號(hào)。 0 3 步驟 裝載探針 對(duì)于刺激時(shí)間較短(通常為2小時(shí)以?xún)?nèi))的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(zhǎng)(通常為6小時(shí)以上)的細(xì)胞，先用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。 原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1:1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通�；钚匝蹶�(yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。 收集細(xì)胞后裝載探針：按照1:1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬(wàn)至二千萬(wàn)/毫升，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通�；钚匝蹶�(yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。 說(shuō)明：僅在陽(yáng)性對(duì)照孔中加入Rosup作為陽(yáng)性對(duì)照，其余孔不必加入Rosup。 檢測(cè) 對(duì)于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。 參數(shù)設(shè)置 使用488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)DCF。 0 4 流式方法檢測(cè)需客戶(hù)提供的資料 1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 2.刺激藥物 實(shí)驗(yàn)流程 細(xì)胞培養(yǎng)——加藥刺激——細(xì)胞標(biāo)記——流式上機(jī)檢測(cè)——結(jié)果分析 結(jié)果 1.流式原始數(shù)據(jù) 2.數(shù)據(jù)分析結(jié)果 3.實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括儀器，試劑及實(shí)驗(yàn)步驟 |
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